桐乡市2014—2015年感染性腹泻副溶血弧菌分离株检测分析

吴龙飞，严卓琳，张轶浙江省桐乡市疾病预防控制中心，浙江桐乡　314500



桐乡市2014
—2015年感染性腹泻副溶血弧菌分离株检测分析

吴龙飞，严卓琳，张轶
浙江省桐乡市疾病预防控制中心，浙江桐乡314500

［摘要］目的了解该市感染性腹泻副溶血弧菌主要血清型、携带毒力因子情况和耐药性情况.方法对2014—2015年期间的40株副溶血弧菌分离株进行血清凝集、毒力基因检测和耐药性分析.结果分离到3种血清型：O3﹕K6 22株（55%），O4﹕K8 12株（30%），O2﹕KUT 2株（5%），另外10%未分型；TDH阳性24株，阳性率60%，TRH阳性0株；对除碳青霉烯类和喹诺酮类外的6大类抗生素均有耐药性，其中对β-内酰胺类、叶酸代谢途径抑制剂及氯霉素的耐药性相对较高，对两种以上抗生素耐的有4株，占10%.结论该市副溶血弧菌感染性腹泻以O3﹕K6为主，毒力基因tdh阳性率较高，对六大类抗生素有耐药性，但耐药性不严重.

［关键词］副溶血弧菌；毒力基因；耐药性；感染性腹泻

副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus，VP）是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛存在于近岸海水和海产品中，可引起人类急性肠胃炎、创伤感染和败血症［1］.食用未经加工成熟的海产品是副溶血性弧菌感染的主要方式.副溶血弧菌致病菌株能产生两种主要致病因子，包括耐热直接溶血素（TDH）和耐热相关溶血素（TRH）.1996年印度加尔各答分离出一种TDH+、TRH-的03：K6型克隆群后，该群副溶血弧菌引起的食物中毒呈明显上升趋势，已经高居病原性食物中毒的首位［2］.由于抗生素的大量使用，副溶血弧菌的耐药性不断增加，因此对其耐药性的研究显得十分重要.该研究对该市2014—2015年分离的40株感染性腹泻副溶血弧菌菌株进行血清学分型、毒力基因检测和耐药性分析，为该病的防控提供技术支撑，报道如下.

1　材料与方法

1.1实验菌株

2014—2015年期间该单位分离的40株感染性腹泻副溶血弧菌菌株，以MicrobankTM磁珠式菌种保藏管冻存于-70℃.

1.2试剂

MicrobankTM磁珠式菌种保藏管购自Pro-Lab Diagnostics；哥伦比亚血琼脂培养基购自贝瑞特生物技术（郑州）有限责任公司；副溶血弧菌K抗原全套诊断血清和副溶血弧菌O抗原全套诊断血清购自日本生研；副溶血弧菌耐热直接溶血素（TDH）检测试剂盒和副溶血弧菌耐热相关溶血素（TRH）检测试剂盒购自上海辉睿生物科技有限公司；Mueller-Hinton琼脂购自北京路桥技术有限责任公司；药敏试剂盒购自杭州天和微生物试剂有限公司.

1.3菌种复苏

将MicrobankTM磁珠式菌种保藏管从-70℃取出，无菌操作打开保藏管，用无菌镊子取出一粒磁珠，划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基.

1.4血清学分型

1.4.1 K抗原凝集用3%氯化钠溶液将可疑菌落制备成108 cfu/mL的菌悬液；在洁净玻片上滴加两滴约15 uL彼此分离的菌悬液；在一滴菌悬液上滴加同体积的血清，在另一滴菌悬液上滴加生理盐水作为对照；分别混匀玻片上的两种混合液；轻轻摇动玻片40 s，观察；于40 s内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性.

1.4.2 O抗原凝集用3%氯化钠溶液将可疑菌落制备成108 cfu/mL的菌悬液；121℃1 h灭活；离心去上清，用同体积的含有5%甘油的3%氯化钠溶液重悬菌体；在洁净玻片上滴加2滴约15 uL彼此分离的菌悬液；在一滴菌悬液上滴加同体积的血清，在另一滴菌悬液上滴加生理盐水作为对照；分别混匀玻片上的两种混合液；轻轻摇动玻片40 s，观察；于40 s内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性.

1.5毒力基因检测

1.5.1模板DNA准备将菌株接种到3%氯化钠碱胨中36℃培养过夜，取1 mL培养液于EP管中，10 000 g离心2 min，弃上清；用去1 mL无酶水洗涤1次；加入200 mL无酶水，100℃水浴10 min后冰浴5 min；8 000 g离心2 min，收集上清液为DNA模板.

1.5.2 TDH/TRH的PCR检测按照副溶血弧菌耐热直接溶血素（TDH）检测试剂盒和副溶血弧菌耐热相关溶血素（TRH）检测试剂盒说明书操作，TDH/TRH反应液各20 μL、待测样品各5 μL.反应条件为95℃，5 min预变性；95℃，10s变性、58℃，45 s退火延伸和检测荧光、40个循环. Ct值＜35，判定为阳性结果；Ct值≥38，判定为阴性结果；35≤Ct值＜38，重复测定2次，Ct值≥38，阴性结果，其中一次Ct值＜38，阳性结果.

1.6耐药性分析

采用纸片扩散法操作，结果参照美国临床实验室标准委员会CLSI标准进行选药及判断，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922.

2　结果

2.1血清学分型

40株副溶血弧菌分离株有4株不能分型，分型率为90%，其中K抗原6株不能分型，分型率为85%；O抗原4株不能分型，分型率为90%.共分离到3种血清型：O3﹕K6 22株（55%），O4﹕K8 12株（30%），O2﹕KUT 2株（5%）.

2.2 tdh/trh毒力基因检测

40株副溶血弧菌分离株检测到tdh阳性株为24株，阳性率60%；未检测到trh阳性株.

2.3药敏试验

副溶血弧菌的药敏结果见表1，结果显示副溶血弧菌分离株对除碳青霉烯类和喹诺酮类外的六大类抗生素均有耐药性，而其中对β-内酰胺类抗生素和叶酸代谢途径抑制剂及氯霉素的耐药性相对较高.氨苄西林的耐药率最高32.5%，其次哌拉西林和复方新诺明12.5%.多重耐药方面，对两种以上抗生素耐药的有4株，占10%.

表1　40株副溶血弧菌分离株对22种抗生素耐药性

3　讨论

自1950年日本大阪首次发现副溶血弧菌感染性腹泻以来，该菌已经引起全世界范围的副溶血弧菌疾病流行［3］.目前已经有至少11种造成流行的血清型被确认［4］，包括O3﹕K6，O4﹕K68，O1﹕K25，O1﹕K41，O1﹕KUT，O1﹕K56，O3﹕K75，O4﹕K8，O4﹕K12，O4﹕KUT和O5﹕KUT（UT代表不能分型）.该市分离到的副溶血弧菌O3﹕K6 22株（55%），O4﹕K8 12株（30%），O2﹕KUT 2株（5%），可见该地患者分离的流行株以O3﹕K6群和O4﹕K8群为主，这与周边其他相关研究结论一致［5-6］.

大部分临床分离株带有tdh基因，或trh基因，或同时带有两种基因，编码TDH耐热直接溶血素和TRH耐热相关溶血素.流行病学调查表明，TDH是副溶血弧菌最主要致病因子是副溶血性弧菌的主要毒力因子.我们通过对40株副溶血弧菌感染性腹泻菌株的PCR检测，检测到tdh基因阳性24株，阳性率60%，而trh基因阳性率为0%.其中O3﹕K6型tdh阳性16株（72.73%），O4﹕K8型tdh阳性5株（62.5%），经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05），可见副溶血弧菌临床分离株血清型与感染力之间不存在相关性.

随着抗生素的广泛使用，副溶血性弧菌耐药性越来越严重.该次使用八大类22种抗生素对40株副溶血弧菌感染性腹泻分离菌株进行药敏试验，结果显示副溶血弧菌分离株对碳青霉烯类和喹诺酮类敏感率为100%，对其他六类抗生素都有一定的耐药性.除对氨苄西林（22.5%）外，对其他抗生素敏感率均在80%以上，提示该市副溶血弧菌分离株耐药性情况相对不是很严重.多重耐药方面，对两种以上抗生素耐药的有4株，占10%，需要注意防止多重耐药性菌株的出现.

通过对桐乡市2年来感染性腹泻副溶血弧菌分离株进行血清分型、毒力因子情况和耐药性情况的检测，更好地了解了该市感染性腹泻副溶血弧菌的特性及耐药问题，从而为副溶血弧菌引起的感染性腹泻提供有效的治疗和控制依据.

［参考文献］

［1］张冲，高翔，甄博珺，等.副溶血弧菌PFGE分型、毒力基因及其耐药性分析［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（4）：1015-1018.

［2］石晓路，王艺，扈庆华，等.深圳地区2002-2008年副溶血弧菌分子特征研究［J］.中华流行病学杂志，2013，34（6）﹕609-613.

［3］Sumio S.Sixty years from thediscovery of Vibrio parahaemoluticus and some recollections［J］.Biocontrol science，2011，16 （4）﹕129-137.

［4］Gonzalez-Escalona N，Strain EA，De Jesus AJ，et al.Genome sequence of the clinical O4﹕K12 serotype vibrio parahaemolyticus strain 10329［J］.Journal of bacteriology，2011，193 （13）﹕3405-3406.

［5］谢红意，周方满，韩东升，等.宁波地区急性腹泻患者副溶血弧菌表型及分子特征研究［J］.临床检验杂志，2013（10）﹕792-794.

［6］陈海丽周海健宰淑蓓，等.2010--2012年上海市两家哨点医院门诊腹泻病例副溶血弧菌感染状况及菌株分子特征分析［J］.中华预防医学杂志，2015，49（3）﹕233-236.

［中图分类号］R155

［文献标识码］A

［文章编号］1672-5654（2016）02（c）-0112-03

DOI：10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.06.112

［作者简介］吴龙飞（1985.11-），男，浙江桐乡人，硕士，技师，研究方向：微生物检验.

收稿日期：（2015-11-16）

The Analysis of Vibrio Parahaemolyticus Isolated from In fectious Diarrhea Patients in Tongxiang City During 2014 to 2015

WU Long-fei，YAN Zhuo-lin，ZHANG Yi
Centers for Disease Control and Prevention，Tongxiang，Zhejiang Province，314500 China

［Abtract］Ob jective To investigate the serotypes，toxic genes and antibiotics resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from infectiousdiarrhea patients in Tongxiang city. Methods 40 Vibrio parahaemolyticus isolatesduring 2014 to 2015 in Tongxiang city were serotyped，thermostabledirect hemolysin gene（tdh）and thermostabledirect hemolysin-related gene（trh）of which weredetermined by PCR，anddrug sensitive was tested by the method ofdiskdiffusion. Results Vibrio parahaemolyticus isolates were serotyped to 3 serotype﹕O3﹕K6﹕55%，O4﹕K8﹕30%，and O2﹕KUT 5%，the rest 10%were unserotyped；24 of 40 weredetermined tdh positive，the positive rate was 60%；none were trh positive；Except carbopenems and quinolones，all the Vibrio parahaemolyticus isolates were resistant to other kinds of antibiotics，showing relatively higher resistance to β-lactams，folate pathway inhibitors and chloromycetins. And there were 4 isolates resistant to more than 2 kinds of antibiotics simultaneously，for 10%. Conclusion The most popular type of Vibrio parahaemolyticus isolated from infectiousdiarrhea patients in Tongxiang city was O3﹕K6；the positive rate of thermostabledirect hemolysin gene（tdh）was relatively high；all the Vibrio parahaemolyticus isolates were resistant to 6 of 8 kind of antibiotics，but not very serious.

［Key words］Vibrio parahaemolyticus；Toxic gene；Antibiotics resistance；Infectiousdiarrhea