金英黄归汤对LPS介导乳腺上皮细胞TLR4信号通路中相关因子的影响

李　欣，李中改，张小艺，周送桂，王玉坤，冯　将，易　琼，王　鲁*

(1.贵州大学 贵州省生化工程中心，贵阳 550025；2.贵州大学 动物科学学院，贵阳 550025；3.贵州大学 药学院，贵阳 550025)



金英黄归汤对LPS介导乳腺上皮细胞TLR4信号通路中相关因子的影响

李欣1，2，李中改1，2，张小艺1，2，周送桂1，3，王玉坤1，2，冯将1，2，易琼1，王鲁1*

(1.贵州大学 贵州省生化工程中心，贵阳 550025；2.贵州大学 动物科学学院，贵阳 550025；3.贵州大学 药学院，贵阳 550025)

摘要：为了评价金英黄归汤抗LPS致炎的作用机制，作者采用ELISA法检测金英黄归汤对细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-8的影响，采用qPCR法研究药物对TLR4通路中IL-1受体相关激酶-1(IRAK-1)、肿瘤坏死因子受体6(TRAF-6)、转化生长因子激活激酶(TAK-1)、NF-κB诱导激酶(NIK)、抑制性NF-κB(IκB) mRNA的转录影响。结果显示，金英黄归汤低剂量组(39.1 μg·mL-1)、中剂量组(391 μg·mL-1)、高剂量组(3 910 μg·mL-1)能显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)减少LPS介导的TNF-α和IL-8分泌；能显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)减少LPS介导的IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、IκB、NIKmRNA的转录。结果提示，金英黄归汤通过抑制小鼠MECs 的TLR4/NF-κB信号通路中IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/NIK途径的活化来控制炎性因子的释放而发挥抗炎作用，而不是通过IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/IκB途径实现的，这可能是金英黄归汤的抗炎机制。

关键词：金英黄归汤；LPS；乳腺上皮细胞；TLR4信号；mRNA转录

在免疫细胞研究中Toll样受体(TLRs)能启动和调节机体炎症和免疫反应[1]，且TLR4是TLRs家族中研究最多的一种，它在脂多糖(LPS)介导的TLR4的途径中有激活髓样分化因子88(MyD88)、IL-1受体相关激酶-1(IRAK-1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)、NF-κB抑制酶(IκB) 或NF-κB诱导激酶(NIK)相关因子参与信号的传导[2]，最终使NF-κB转移至核内启动相关基因的转录，细胞分泌前炎症因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等。前期研究发现小鼠MECs细胞膜上存在TLR2和TLR4受体，TLR4是小鼠MECs上LPS介导细胞因子TNF-α、IL-8分泌的主要受体[3]。

近年来有大量研究报道中药复方、中药提取物及中药有效成分对TLR4/NF-κB信号通路具有调节作用，并用以探讨中药对相关疾病治疗的分子基础[4-6]。前期研究发现金英黄归汤具有良好的抗炎作用[7]，对金黄色葡萄球菌所致乳房炎家兔血清及乳汁中IL-6和TNF-α的分泌也有显著的抑制作用[8]。在此基础上，本试验以LPS刺激小鼠MECs，研究金英黄归汤对TLR4/NF-κB信号通路的IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、IκB、NIKmRNA转录的影响，旨在研究金英黄归汤的抗炎机制。

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级3月龄的妊娠中期昆明小白鼠，体重35 g±5 g，购自解放军第三军医大学实验动物中心[动物许可证号：SCXK(渝) 2012-0003]，在贵州大学贵州省生化工程中心SPF级动物实验室[动物许可证号：SYXK(黔) 2013-0001]饲养。

1.2主要药物

金英黄归汤中金银花、蒲公英、连翘、大黄、黄芪、当归、瓜萎、芙蓉花8味中药，购于贵阳市同济堂药店(中药GMP认证号：黔J0190)，按文献[8]制备成生药浓度为1 g·mL-1，0.22 μm滤膜过滤除菌。4 ℃保存备用。

1.3主要试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清，Thermo scientific公司；小鼠表皮生长因子，SAB公司；胰岛素、霍乱毒素CT、L-谷氨酰胺、LPS，Sigma公司；Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，Solarbio公司；Trypsin-EDTA，Invitrogen公司；Mouse TNF-α and IL-8 ELISA试剂盒，IBL公司。TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，北京TIANGEN生物技术有限公司；动物组织/细胞RNA提取试剂盒，2×EsTaq MasterMix，北京康为世纪生物科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix，AB公司；注射用青霉素钠和硫酸链霉素，华北制药股份有限公司；氢化可的松，天津药业焦作有限公司；无水乙醇、氯仿、甲醛、异丙醇，均为国产化学纯试剂。

1.4主要实验仪器

ThermoFisher 8000储水型CO2细胞培养箱，Thermo公司；MultiskanGo型全波段酶标仪，Thermo公司；qTOWER实时荧光定量RT-PCR仪，德国jena公司；T100 Thermal Cycler温度梯度PCR仪，GelDoc XR+凝胶成像系统，BIO-RAD公司。

1.5金英黄归汤对LPS介导小鼠MECs分泌IL-8和TNF-α的影响

参照文献方法[3]制备小鼠MECs，将500 μL 5×104·mL-1的细胞悬液加入24孔板中，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养，及时换液，当MECs生长融合成单层细胞时，随机分为5组：空白对照组、LPS刺激组、金英黄归汤低剂量组、金英黄归汤中剂量组、金英黄归汤高剂量组。各组分别以下列方法干预：空白对照组：只加MECs培养液500 μL。LPS刺激组：含有10 μg·mL-1LPS(终质量浓度)MECs培养液500 μL。金英黄归汤低剂量组：加入含有10 μg·mL-1LPS+39.1 μg·mL-1(终质量浓度)金英黄归汤的MECs培养液500 μL。金英黄归汤中剂量组：加入含有10 μg·mL-1LPS+391 μg·mL-1(终质量浓度)金英黄归汤的MECs培养液500 μL，金英黄归汤高剂量组：加入含有10 μg·mL-1LPS+3 910 μg·mL-1(终质量浓度)金英黄归汤的MECs培养液500 μL。在37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h后收集细胞。取每孔上清液，按照ELISA试剂盒说明书方法分别测定其IL-8和TNF-α的分泌量。

1.6金英黄归汤对LPS介导小鼠MECs中IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK、IκBmRNA转录的影响

按上述方法制备细胞及给药，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h后收集细胞。使用动物组织/细胞RNA提取试剂盒提取各组细胞的RNA，并检测其纯度与浓度，检测合格后，尽快用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒将提取的RNA逆转录，并于-80 ℃保存备用。IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK、IκB基因序列从GenBank获得，使用Primer 5.0设计引物(表1)，由上海生工合成。以GAPDH为内参基因，采用梯度PCR技术检测各基因的最佳退火温度(表1)。

10 μL反应体系中，加入5 μL SYBR Green，2 μL模板cDNA，0.8 μL引物，用无RNase的水补充体积至10 μL。然后进行PCR反应和荧光测定。荧光定量RT-PCR反应程序：95 ℃预热5 min；95 ℃变性30 s，退火温度(表1)30 s，72 ℃延伸30 s，自变性开始三步为一个循环，共设40个循环；72 ℃延伸2 min，使产物延伸完全。反应结束后自50 ℃至95 ℃绘制熔解曲线。测定结果用2-ΔΔCt的方法计算得到各组mRNA的转录量。

表1　qPCR 的引物序列及退火温度

1.7统计学处理

2结果

2.1金英黄归汤对LPS介导小鼠MECs分泌IL-8和TNF-α的影响

试验结果显示，与空白组相比，LPS刺激组的IL-8分泌量极显著升高(P<0.01)，金英黄归汤低、中、高剂量组IL-8的分泌量差异不显著(P>0.05)；与LPS刺激组比较，金英黄归汤低、中、高剂量组IL-8的分泌量分别显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低，且细胞分泌IL-8的分泌量与中药浓度呈一定的量效关系，随着中药浓度的增加而减少，并回到空白组水平，结果见图1。

**.与空白组相比，P<0.01； #，##.与LPS组相比，P<0.05，P<0.01。下同**.Compared with control，P<0.01; #，##. Compared with LPS，P<0.05，P<0.01.The same as below图1　金英黄归汤对MECs分泌IL-8的影响Fig.1　Influence of JYT on IL-8 of MECs culture supernatants

试验结果显示，与空白组相比，LPS刺激组TNF-α的分泌量显著升高(P<0.05)，金英黄归汤低、中、高剂量组TNF-α的分泌量差异不显著(P>0.05)；与LPS刺激组比较，金英黄归汤低、中、高剂量组TNF-α的分泌量则分别极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)降低，且也回到空白组水平，结果见图2。

图2　金英黄归汤对MECs分泌TNF-α的影响Fig.2　Influence of JYT on TNF-α of MECs culture supernatants

2.2金英黄归汤对LPS导致小鼠MECs中IRAK-1 mRNA转录的影响

与空白组相比，LPS刺激组IRAK-1 mRNA转录量极显著上升(P<0.01)，金英黄归汤低剂量组的转录量也显著上升(P<0.05)，但金英黄归汤中、高剂量组的转录量下降，且差异不显著(P>0.05)；与LPS刺激组相比，金英黄归汤各剂量组均极显著下调IRAK-1的转录(P<0.01)，IRAK-1 mRNA的转录量与中药浓度呈一定的量效关系，随着中药浓度的增加而减少，且回到空白组水平，结果见图3。

图3　金英黄归汤对MECs IRAK-1 mRNA转录的影响Fig.3　Influence of JYT on IRAK-1 mRNA expression in MECs

2.3金英黄归汤对LPS导致小鼠MECs中TRAF-6 mRNA转录的影响

图4　金英黄归汤对MECs TRAF-6 mRNA转录的影响Fig.4　Influence of JYT on TRAF-6 mRNA expression in MECs

与空白组相比，LPS刺激组TRAF-6 mRNA转录量极显著上升(P<0.01)，金英黄归汤低浓度组的转录量也极显著上升(P<0.01)，但金英黄归汤中、高浓度组的转录量差异不显著(P>0.05)；与LPS刺激组相比，金英黄归汤各剂量组均极显著下调TRAF-6的转录(P<0.01)，TRAF-6 mRNA的转录量与中药浓度呈一定的量效关系，随着中药浓度的增加而减少，且回到空白组水平，结果见图4。

2.4金英黄归汤对LPS导致小鼠MECs中TAK-1 mRNA转录的影响

与空白组相比，LPS刺激组TAK-1 mRNA转录量极显著上升(P<0.01)，金英黄归汤低剂量组的转录量差异不显著(P>0.05)，但金英黄归汤中、高浓度组的转录量极显著下调(P<0.01)；与LPS刺激组相比，金英黄归汤各剂量组均极显著的下调TAK-1的转录(P<0.01)，TAK-1 mRNA的转录量与中药浓度呈一定的量效关系，结果见图5。

图5　金英黄归汤对MECs TAK-1 mRNA转录的影响Fig.5　Influence of JYT on TAK-1 mRNA expression in MECs

2.5金英黄归汤对LPS导致小鼠MECs中NIKmRNA转录的影响

与空白组相比，LPS刺激组NIKmRNA转录量极显著上升(P<0.01)，金英黄归汤低剂量组的转录量也极显著上升(P<0.01)，但金英黄归汤中、高浓度组的转录量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下调；与LPS刺激组相比，金英黄归汤低浓度组则极显著上调NIK的转录(P<0.01)，而中、高浓度组均极显著下调NIK的转录(P<0.01)。NIKmRNA的转录量与中药浓度呈一定的量效关系，结果见图6。

图6　金英黄归汤对MECs NIK mRNA转录的影响Fig.6　Influence of JYT on NIK mRNA expression in MECs

2.6金英黄归汤对LPS导致小鼠MECs中IκBmRNA转录的影响

与空白组相比，LPS刺激组、金英黄归汤各浓度组IκBmRNA转录呈极显著下调(P<0.01)，与LPS刺激组相比，金英黄归汤各浓度组均显著或极显著的下调IκB的转录(P<0.05，P<0.01)。结果详见图7。

3讨论

MECs在病原微生物侵入乳腺时，能分泌细胞调节因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α[9-10]，这些活性成分对乳腺炎的发生与病程发展起重要作用，它们能趋化中性粒细胞进入乳腺感染区，抵抗病原菌的感染[11]，这对疾病的控制是有利的，但细胞受致炎因子刺激，机体过度活化后影响了其正常的功能，从这角度来说对机体是不利的，所以减少致炎因子所致细胞因子分泌更具有科学意义。本试验结果进一步证实了LPS可以导致小鼠MECs分泌IL-8和TNF-α[3]，更重要的是发现适宜浓度的金英黄归汤可抑制LPS所致小鼠MECs分泌IL-8和/或TNF-α，这为金英黄归汤对抗LPS的生物活性提供了数据，为进一步研究金英黄归汤在LPS导致信号通路的研究打下基础。

LPS是TLR4的天然配体，在免疫细胞上的TLR4接受LPS刺激后，将信号转到细胞内，可激活MyD88依赖和非依赖的TLR4信号通路[2]，MyD88依赖途径是MyD88和MyD88样接头蛋白(MAL)聚集到TLR4形成受体复合体。IRAK-1和IRAK-4与该受体复合物结合后，引起IRAK-1的磷酸化，使其从受体复合体上解离，并结合活化TAK-1结合蛋白1(TAB1)和TAB2以及TRAF-6并使其活化。活化的TRAF-6激活NF-κB转移至核内启动相关基因的转录最终细胞分泌前炎症因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等。前期研究发现金英黄归汤能降低LPS刺激小鼠MECs后TLR4、MyD88的mRNA的转录[12]。为了进一步研究金英黄归汤对TLR4信号通路中从MyD88之后起至NF-κB段相关因子的影响，设计了本试验。试验结果显示，LPS刺激小鼠MECs后，IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK都极显著的升高，IκB极显著的降低，说明小鼠MECs的TLR4信号传导与免疫细胞的信号传导途径是一致的，这为TLR4信号通路的研究增加了MECs的研究数据。结果还显示，金英黄归汤能降低LPS刺激小鼠MECs后IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK的mRNA的转录，这说明金英黄归汤抑制LPS所致小鼠MECs分泌IL-8和/或TNF-α的机制之一可能是抑制TLR4信号通路中IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK的转录。

NF-κB激活的经典途径是抑制IκB而实现，NF-κB激活的非经典途径通过NIK实现的[13]。试验结果证实了LPS能导致小鼠MECs的IκB的mRNA转录极显著下降，NIK的mRNA转录极显著上升，这可推断LPS是通过IκB途径和或NIK途径活化NF-κB。试验结果发现金英黄归汤能显著促进LPS介导小鼠MECs的IκB的mRNA转录下降，极显著抑制的NIKmRNA转录上升，我们推测金英黄归汤可能是从NIK途径而不是从IκB途径减少NF-κB活化，最终降低细胞分泌细胞因子。NF-κB是核转录因子，由于影响其活性及活化有多条途径，金英黄归汤对NF-κB活性及活化如何有待进一步深入研究。

4结论

MECs在病原微生物侵入乳腺时，能分泌细胞调节因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，这对乳腺炎的发生与病程发展起重要作用，中药复方金英黄归汤可抑制LPS所致小鼠MECs分泌IL-8和/或TNF-α，其机制是抑制LPS介导的TLR4信号通路中IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK的mRNA转录。并可能从NIK途径而不是从IκB途径减少NF-κB活化，最终降低细胞分泌细胞因子。

参考文献(References)：

[1]HIGGS R，CORMICAN P，CAHALANE S， et al.Induction of a novel chicken Toll-like receptor following Salmonella enterica serovar Typhimurium infection[J].InfectImmun，2006，74(3)：1692-1698.

[2]KAWAI T，AKIRA S.Toll-like receptor downstream signaling[J].ArthritisResTher，2005，7(1):12-19.

[3]HE C L，YI Q，LI Y F， et al.Toll-like receptor-4，but not toll-like receptor-2 mediates secretion of tumour necrosis factor α and interleukin-8 in lipopolysaccharide-stimulated mouse mammary epithelial cells[J].BulletinoftheVeterinaryInstituteinPulawy，2013，57(3)：393-397.

[4]ZHU H，ZHANG Y，HU X，et al.The effects of high-dose qinggan huoxue recipe on acute liver failure induced by d-galactosamine in rats[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2013，2013：905715.

[5]LI H L，CHEN H I，LI H， et al.Regulatory effects of emodin on NF-kappaB activation and inflammatory cytokine expression in RAW 264.7 macrophages[J].IntJMolMed，2005，16(1):41-47.

[6]SINTARA K，THONG-NGAM D，PATUMRAIJ S，et al.Curcumin suppresses gastric NF-κB activation and macromolecular leakage in Helicobacter pylori-infected rats[J].WorldJGastroenterol，2010，16(32):4039-4046.

[7]覃英克，郭庆，肖纯刚，等.8个中药组方抗炎活性的筛选[J].黑龙江畜牧兽医，2011(11)：126-127.

TAN Y K，GUO Q，XIAO C G，et al.Screening of eight Chinese medicine prescription in anti-inflammatory activity[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2011(11)：126-127.(in Chinese)

[8]WANG L U，HE C L，HE B K， et al.Effects of Jin-Ying-Tang onStaphylococcusaureus-induced mastitis in rabbit[J].ImmunopharmacolImmunotoxicol，2012，34(5)：786-793.

[9]PAREEK R，WELLNITZ O，VAN DORP R，et al.Immunorelevant gene expression in LPS-challenged bovine mammary epithelial cells[J].JApplGenet，2005，46(2)：171-177.

[10]WELLNITZ O，KERR D E.Cryopreserved bovine mammary cells to model epithelial response to infection[J].VetImmunolImmunopathol，2004，101(3-4)：191-202.

[11]PAAPE M，MEHRZAD J，ZHAO X，et al.Defense of the bovine mammary gland by polymorphonuclear neutrophil leukocytes[J].JMammaryGlandBiolNeoplasia，2002，7(2)：109-121.

[12]李圆方.“金英黄归汤”对小鼠乳腺上皮TLR4信号转导的影响[D].贵州：贵州大学，2013.

LI Y F.Regulated effects of Jin-Ying-Huang-Gui decoction on the TLR4 signaling of mouse mammary epithelial cellsinvitro[D].Guizhou：Guizhou University，2013.(in Chinese)

[13]SUN S C.The noncanonical NF-κB pathway[J].ImmunolRev，2012，246(1)：125-140.

(编辑白永平)

Effects of Jin-Ying-Tang on Correlated Molecules of Toll-like Receptor 4 Signaling of LPS-Induced Mouse Mammary Epithelial Cellsinvitro

LI Xin1，2，LI Zhong-gai1，2，ZHANG Xiao-yi1，2，ZHOU Song-gui1，3，WANG Yu-kun1，2，FENG Jiang1，2，YI Qiong1，WANG Lu1*

(1.BiochemistryEngineeringCenterofGuizhouProvince，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；3.CollegeofPharmacy，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Abstract:The study was conducted to investigate the effects of Jin-Ying-Tang (JYT) on correlated molecules of TLR4/NF-κB signaling of LPS-stimulated mouse mammary epithelial cells(MECs)invitroand explore its underlying molecular mechanisms.ELISA was performed to detect changes of the content of IL-8 and TNF-α in the culture supernatants.The mRNA transcription of TLR4-NF-κB signaling molecules such as IL-1 receptor-associated kinase-1(IRAK-1)，tumour necrosis factor receptor associated factor 6(TRAF-6)，Transforming Growth Factor activated kinase 1(TAK-1)，NF-κB inducing kinase(NIK)，Inhibitor of κB(IκB) were determined by qRT-PCR.The results showed that JYT could significantly decrease the expression of IL-8 and TNF-α in LPS-stimulated MECs(P<0.05，P<0.01)；what’s more，JYT could down-regulate the expression ofIRAK-1，TRAF-6，TAK-1，IκB，NIKmRNA activated by LPS(P<0.05，P<0.01).It is concluded that JYT attenuates LPS-induced inflammatory response in MECs by inhibiting the activitation of IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/NIK pathway，but not of IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/IκB pathway.

Key words:Jin-Ying-Tang；LPS；mammary epithelial cells；TLR4/NF-κB signaling；mRNA expression

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.026

收稿日期：2015-08-12

基金项目：国家自然科学基金项目(31260618；31470128)；北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室开放课题

作者简介：李欣(1991-)，男，吉林通化人，硕士生，主要从事中药药理学研究，E-mail：690079602@qq.com *通信作者：王鲁(1970-)，教授，博士，主要从事中兽医学及中药药理学研究，E-mail：wanglu7007@163.com

中图分类号：S853.9

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)03-0609-06