鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

黄　慧，刘保光，孙亚伟，马彩珲，陈丽鹏，苑　丽，潘玉善，胡功政*

(1河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；2 河南科技学院动物科技学院，新乡 453001)



鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

黄慧1，刘保光1，孙亚伟2，马彩珲1，陈丽鹏1，苑丽1，潘玉善1，胡功政1*

(1河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；2 河南科技学院动物科技学院，新乡 453001)

摘要：为了探索cpxR基因对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制，同时避免外排泵acrB的存在掩盖cpxR对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用，利用基于Red同源重组系统的一步法失活染色体基因，用含有同源臂的线性打靶DNA片段替换目的基因，构建鼠伤寒沙门菌JS株的acrB基因缺失株JSΔacrB。然后利用噬菌体转导技术，以前期构建的cpxR缺失株JSΔcpxR∷kan为供体菌，本研究新构建的JSΔacrB为受体菌，在P22噬菌体的作用下构建双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan，同时制备cpxR基因回补菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。最后用微量稀释法测定10种临床常用代表性抗菌药物对JS和各缺失株的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,成功构建鼠伤寒沙门菌的双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan以及其cpxR基因互补菌株JSΔacrBΔcpxR/pcpxR。MIC结果显示，acrB基因缺失后，多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值分别降低32、4、4、16、32、4、2和128倍；双基因缺失后，多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的MIC值进一步降低2、8、2和2倍；而将cpxR基因回补之后，这4种抗菌药物的MIC值会升高4、16、2和4倍。结果表明，cpxR能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。

关键词：鼠伤寒沙门菌；cpxR；acrB；双基因缺失；MIC

CpxAR系统是革兰阴性菌中普遍存在的与耐药性和致病性相关的一种双组分信号转导系统(two-component signal transduction system，TCS)，其应答调控子CpxR含有多个可与不同的DNA序列特异性结合的位点[1]，可有选择地上调或下调基因的转录从而调控细菌的生命活动。有研究显示，CpxR可调控大肠杆菌对新生霉素、卡那霉素[2]以及部分β-内酰胺类抗生素[3](苯唑西林、头孢美唑等六种药物)的耐药性。W.S.Hu等[4]将鼠伤寒沙门菌头孢曲松耐药菌株R200的cpxAR敲除后，发现菌株对头孢菌素、头孢羟唑的耐药性明显降低，对四环素、链霉素、氯霉素、庆大霉素等药物的耐药性也有不同幅度的降低。T.F.Mahoney等[5]的研究显示，CpxR磷酸化后能降低氨基糖苷类药物和羟基脲的敏感性。这些初步表明：CpxAR对细菌多重耐药性(multidrug resistance，MDR)有重要调控作用。

主动外排系统是MDR形成的一个重要机制，阴性菌中有多个外排系统与MDR有关，其中AcrAB-TolC是MDR形成最重要的外排系统。现有的研究表明：acrAB的表达不受任何双组份调控子的调控[2]，不同的双组分信号转导系统对MDR的调控是通过调控acrB以外的其他外排泵来实现[2，6-8]，但acrB的存在和表达可能会掩盖其他外排系统的作用[9]。H.Hirakawa等[2]的研究发现在acrB缺失大肠杆菌中，cpxR可上调外排泵acrD的表达量。W.S.Hu等[4]的研究发现cpxAR的缺失可影响外排泵acrD和acrF的表达量。而K.Nishino等[10]的研究发现BaeSR、AcrD和MdtABC对耐药性的调控作用只能在acrB缺失菌中被观察到。目前未见有鼠伤寒沙门菌acrB缺失时，研究cpxR对细菌抗菌药物敏感性影响的报道。作者前期已将鼠伤寒沙门菌cpxR基因敲除并进行了回补试验，初步证实了cpxR可影响鼠伤寒沙门菌对β-内酰胺类的头孢曲松和头孢噻呋以及氨基糖苷类的阿米卡星和庆大霉素的敏感性。本研究为避免acrB的存在掩盖cpxR对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用，构建cpxR和acrB双基因缺失株，并分析该缺失株对抗菌药物敏感性的变化，为阐明cpxR调控鼠伤寒沙门菌MDR作用的分子机制奠定基础。

1材料与方法

1.1菌株和质粒

鼠伤寒沙门菌标准菌种(CVCC541，以下命名为JS)：本实验室保存，源自中国兽医药品监察所；质控菌：大肠埃希菌ATCC®25922，购自中国普通微生物菌种保存中心；pKD4质粒、pKD46质粒、pCP20质粒：本实验室保存；沙门菌噬菌体P22HT105/int：河南科技学院馈赠。

1.2主要试剂和药品

LB肉汤、LB琼脂、MH肉汤等培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；质粒小量提取试剂盒购自美国OMEGA公司；BM5000 DNA Marker购自北京Biomed公司；PrimerSTAR Max Premix(2×)购自TaKaRa公司；pGEM-T Easy Vector购自Promega公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物有限公司；PCR引物由上海生工公司合成；氨苄青霉素、卡那霉素购于上海生工生物工程有限公司；多西环素、土霉素、庆大霉素、阿米卡星、喹乙醇、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松、头孢噻呋均为国产原料药，符合中国药典或中国兽药典质量标准，使用前置4 ℃冰箱保存，使用时均在有效期之内。

1.3acrB基因缺失株的构建

1.3.1引物设计根据GenBank数据库公布的鼠伤寒沙门菌acrB基因全序列(HG326213.1)，利用Primer 5.0软件设计3对特异性引物，其中LBF/LBR为acrB基因敲除引物(其5′末端的部分序列与acrB两侧序列同源，靠近3′末端的部分序列与质粒pKD4上kan两侧序列互补)，用于同源重组；BF/BR为acrB敲除鉴定引物，用于检测acrB缺失突变株；Cr-F/Cr-R为cpxR基因失活鉴定引物，与BF/BR同时用来鉴定cpxR和acrB双基因缺失突变株，引物序列见表1。

1.3.2一步法失活acrB基因[11]以pKD4质粒为模板，用LBF/LBR引物扩增两侧带有FRT位点的kan及acrB两侧同源臂的线性融合PCR产物(线性打靶DNA片段)。将编码Red重组系统的pKD46质粒电击转化到JS感受态细胞，经10 mmol·L-1的L-阿拉伯糖诱导后，将线性融合PCR产物电击转化入JS/pKD46感受态细胞中，在kanr(25 μg·mL-1)的LB平板上筛选重组突变体。将阳性重组突变体置42 ℃培养6 h，再在LB琼脂平板上37 ℃培养过夜，筛选出仅在kanr的LB中生长的突变体，即为带有kan基因的acrB缺失突变体JSΔacrB∷kan，此时质粒pKD46被消除。将pCP20质粒电击转化导入JSΔacrB∷kan，42 ℃振荡培养6 h后，筛选无ampr和kanr的突变体，此突变体kan基因被消除，只剩下一个FRT位点，即JSΔacrB。最后以其基因组DNA为模板，用JS做对照，用BF/BR引物进行PCR鉴定，同时PCR产物测序验证。

表1　鼠伤寒沙门菌cpxR基因同源重组引物

带下划横线的碱基为同源臂

The underlined bases are the homologous arms

1.4cpxR和acrB双基因缺失株的构建

利用噬菌体转导技术[12]，以本实验室已构建好的kan替代cpxR基因后的菌株JSΔcpxR∷kan为供体菌，JSΔacrB为受体菌，制备双基因缺失菌株(图1)。

1.4.1噬菌体增殖挑取JS单个菌落接种于LB肉汤培养基中，37 ℃振荡培养，使其浓度达到108CFU·mL-1。取噬菌体原液100 μL加入到10 mL细菌培养液中，37 ℃静置20 min，使噬菌体吸附细菌，后置37 ℃振荡培养5～8 h，可见细菌被裂解。加入100 μL氯仿，振荡混匀，离心取上清液用0.22 μm滤膜过滤，即得较纯的噬菌体，4 ℃保存。将噬菌体增殖液与LB琼脂制成双层琼脂培养板，观察噬菌斑的形成并进行噬菌斑计数。

1.4.2含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒的制备挑取供体菌JSΔcpxR∷kan单个菌落接种于10 mL LB肉汤培养基中，37 ℃振荡培养过夜，后加入适量的噬菌体增殖液，37 ℃静置20 min后振荡培养5～8 h，制备出含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒。

1.4.3噬菌体转导挑取受体菌JSΔacrB单菌落接种于10 mL LB肉汤培养基中，37 ℃振荡培养过夜，取10 μL含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒与190 μL过夜培养的受体菌JSΔacrB菌液混合，室温静置20 min，后加入1 mL LB肉汤培养基，37 ℃振荡培养30 min。离心收集细菌沉淀，用100 μL LB肉汤培养基悬浮，后涂布于的kanr(50 μg·mL-1)LB琼脂平板上，筛选阳性转导子。

1.4.5转导子的鉴定挑取筛选平板上的单克隆接种于5 mLkanr(50 μg·mL-1)的LB肉汤培养基中过夜培养，提取细菌DNA，进行PCR鉴定，鉴定引物见表1。同时将PCR产物送华大基因公司测序以验证。

H1、H2.同源臂；LBF/LBR.扩增线性打靶DNA片段的引物；Cr-F/Cr-R.鉴定cpxR缺失的引物；BF/BR.鉴定acrB缺失的引物H1，H2.Homologous arms；LBF/LBR.Primers for the amplification of the linear target DNA fragment；Cr-F/Cr-R.Primers for the confirmation of cpxR deletion；BF/BR.Primers for the confirmation of acrB deletion图1　双基因缺失过程及引物使用策略Fig.1　The strategy of two gene deletion and the using of primers

1.5cpxR基因回补菌株的构建

将事先构建好的pBAD-CpxR表达质粒电转化导入双基因缺失菌株中，获得回补菌株，命名为JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。

1.6MIC值的测定

用微量肉汤稀释法[13-14]测定10种抗菌药物多西环素、土霉素、庆大霉素、阿米卡星、喹乙醇、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松、头孢噻呋对JS、JSΔacrB、JSΔacrBΔcpxR∷kan和JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR的最小抑菌浓度(MIC)，质控菌为大肠杆菌ATCC®25922，试验重复3次，结果取平均值。

2结果

2.1acrB基因缺失株的鉴定

用引物BF/BR对acrB基因敲除前后的菌株JS和JSΔacrB进行PCR 扩增，分别扩增出大小为4 000 bp左右和1 400 bp左右的片段，如图2。同时测序结果也证明acrB被成功敲除，只剩83 bp的残留FRT位点。

2.2cpxR和acrB双基因缺失株的鉴定

2.2.1噬菌斑的形成噬菌体增殖后，在双层琼脂培养板上形成明显的噬菌斑，如图3。

M.BM5000 DNA相对分子质量标准；1.用BF/BR引物扩增JS的acrB基因；2.用BF/BR引物扩增JSΔacrB的acrB基因缺失后的片段M.BM5000 DNA marker；1. acrB gene amplified from JS by primers BF/BR；2.The fragment amplified from JSΔacrB by primers BF/BR图2　acrB基因缺失株的PCR鉴定Fig.2　Identification of acrB gene deletion by PCR

2.2.2转导子的筛选与鉴定含有ΔcpxR∷kan片段的噬菌粒与受体菌JSΔacrB混合培养后，在kanr(50 μg·mL-1)LB琼脂平板上长出kanr的转导子，如图4A所示，说明噬菌粒已将ΔcpxR∷kan片段传导给受体菌JSΔacrB。挑取转导子的单克隆，用cpxR缺失，鉴定引物Cr-F/Cr-R和acrB缺失鉴定引物BF/BR分别进行PCR扩增，1.0%琼脂糖电泳均出现预期大小的条带，如图4B。同时测序结果也证实筛选的转导子为cpxR和acrB双基因缺失株。

2.3药敏试验

图3　噬菌体P22HT105/int侵染鼠伤寒沙门菌后形成的噬菌斑Fig.3　The plaques assay after the infection of Salmonella Typhimurium by P22HT105/int

药敏试验中，质控菌大肠杆菌ATCC®25922对所有抗菌药物均敏感，每种抗菌药物的MIC值均在CLSI[13-14]允许的范围内(喹乙醇暂无质控菌的标准数据)。acrB缺失后，与亲本菌JS相比，对多种抗菌药物的敏感性均明显升高，多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值分别降低了32、4、4、16、32、4、2和128倍；双基因缺失后，其中4种抗菌药物(多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋)的MIC值分别又降低了2、8、2和2倍；而将cpxR基因回补到双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan中后，这4种抗菌药物的 MIC值分别升高了4、16、2和4倍，且头孢曲松的MIC也升高了2倍(表2)。

A.kanr平板上白色菌落即为阳性转导子所形成的菌落；B.PCR鉴定； M.BM5000 DNA相对分子质量标准 1.引物Cr-F/Cr-R扩增菌株JSΔcpxR∷kan所得产物；2.引物BF/BR扩增菌株JSΔcpxR∷kan所得片段；3.引物 Cr-F/Cr-R 扩增菌株JSΔacrB所得产物；4.引物BF/BR扩增菌株JSΔacrB所得片段；5.用引物Cr-F/Cr-R 扩增菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan所得片段；6.引物BF/BR 扩增JSΔacrBΔcpxR∷kan所得片段A.Positive transductants grow on the kanamycin resistant plate；B.PCR；M.BM5000 DNA marker；1.The fragment amplified from JSΔcpxR∷kan by primers Cr-F/Cr-R；2.The fragment amplified from JSΔcpxR∷kan by primers BF/BR；3.The fragment amplified from JSΔacrB by primers Cr-F/Cr-R；4.The fragment amplified from JSΔacrB by primers BF/BR；5.The fragment amplified from JSΔacrBΔcpxR∷kan by primers Cr-F/Cr-R；6.The fragment amplified from JSΔacrBΔcpxR∷kan by primers BF/BR图4　转导子的筛选与PCR鉴定Fig.4　Screening and confirmation of the transductants by PCR

表2　双基因缺失株对10种临床常用代表药物的敏感性检测(MIC)

a不加诱导剂和0.2%的L-阿拉伯糖诱导

aStrain was uninduced or induced by 0.2% L-arabinose

3讨论

随着分子遗传学的发展，噬菌体转导已成为基因精细结构分析的常用方法，它是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。作者首先利用基于λ噬菌体短同源序列重组功能的Red同源重组系统分别构建鼠伤寒沙门菌cpxR缺失株和acrB缺失株，然后利用噬菌体转导方法，在P22噬菌体的作用下将cpxR失活片段转移给acrB缺失株，成功构建鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株。该方法不需要限制性内切核酸酶和连接酶，不需要复杂的体外重组操作，高效、简单、可操作性强。

本研究中，鼠伤寒沙门菌acrB缺失后，其对多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢噻呋的敏感性均明显增强，尤其是对多西环素、环丙沙星、恩诺沙星和头孢噻呋(MIC值降低16～128倍)。多重耐药泵acrB具有广泛的底物，包括氟喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类和大环内酯类等[15]。S.Baucheron等的研究发现acrB在鼠伤寒沙门菌的氟喹诺酮类药物抗性中发挥重要作用，acrB的失活可使恩诺沙星耐药性降低32倍[16]。孟春萍[17]在鸭源大肠杆菌中缺失acrB时，发现庆大霉素、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素的MIC值分别降低2、133、8、66、16倍。本研究在鼠伤寒沙门菌中敲除acrB后MIC变化与以往的报道基本一致，说明acrB作为最主要的外排泵对鼠伤寒沙门菌MDR形成尤其是氟喹诺酮类和β-内酰胺类药物耐药性形成中发挥重要作用。在acrB基因缺失中同时缺失cpxR基因时，菌株对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋这四种药物的敏感性进一步升高(2～8倍)，土霉素和头孢曲松分别与多西环素和头孢噻呋属同一类药物，而它们的敏感性却未发生变化，可能是因为cpxR对MDR的调控是通过调控外排泵和外膜蛋白来实现的，而相关的外排泵或外膜蛋白对同一类的不同药物的外排能力和渗透能力可能不同；在acrB和cpxR双基因缺失株中将cpxR回补后，菌株对多西环素、庆大霉素、阿米卡星、头孢曲松和头孢噻呋的敏感性却有不同程度的降低(2～16倍)。这一结果说明cpxR可调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。前期通过构建cpxR基因缺失株进行药物敏感性分析，发现cpxR可影响鼠伤寒沙门菌对庆大霉素、阿米卡星、头孢曲松和头孢噻呋的敏感性，本研究通过构建acrB和cpxR双基因缺失株后进行药物敏感性分析，发现cpxR还可影响鼠伤寒沙门菌对多西环素的敏感性。

K.Nishino等发现细菌TCS中的应答调控子可通过调控一些药物转运基因的表达而调控细菌的MDR，例如，大肠杆菌双组分调控子EvgA可上调药物外排基因emrKY、yhiUV的表达[6-7]，BeaR可上调控外排泵acrD和mdtABC的表达[2，8]。沙门菌的9个功能性药物外排泵中，acrB是MDR形成最重要的外排泵，acrD被证实是调控大肠杆菌对氨基糖苷类敏感性的重要外排泵[18]，也有研究证实大肠杆菌对β-内酰胺类敏感性主要受依赖TolC的5种RND家族外排系统(acrAB、acrD、acrEF、mdtABC、mdtEF)的协调调控[9]，W.S.Hu等[4]发现cpxAR可影响外排泵acrD、acrF以及部分外膜蛋白的表达量。本试验中cpxR缺失后，菌株对多西环素、庆大霉素、阿米卡星、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值降低，可能与其调控外排泵acrD及外膜蛋白的表达量有关。然而，cpxR具体是调控哪些外排泵或外膜蛋白基因以及其调控机制还需进一步研究。

4结论

构建鼠伤寒沙门菌JS株的cpxR和acrB双基因缺失株，并分析其对抗菌药物敏感性的变化。发现cpxR能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。

参考文献(References)：

[1]STEPHENSON K，HOCH J A.Two-component and phosphorelay signal-transduction systems as therapeutic targets[J].CurrOpinPharmacol，2002，2(5)：507-512.

[2]HIRAKAWA H，NISHINO K，HIRATA T，et al.Comprehensive studies on the drug resistance mediated by overexpression of response regulators of two-component signal transduction systems inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2003，185(6)：1851-1856.

[3]HIRAKAWA H，NISHINO K，YAMADA J，et al.β-lactam resistance modulated by the overexpression of response regulators of two-component signal transduction systems inEscherichiacoli[J].JAntimicrobChemother，2003，52(4)：576-582.

[4]HU W S，CHEN H W，ZHANG R Y，et al.The expression levels of outer membrane proteins STM1530 and OmpD，which are influenced by the CpxAR and BaeSR two-component systems，play important roles in the ceftriaxone resistance ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium[J].AntimicrobAgentsChemother，2011，55(8)：3829-3837.

[5]MAHONEY T F，SILHAVY T J.The Cpx stress response confers resistance to some，but not all，bactericidal antibiotics[J].JBacteriol，2013，195(9)：1869-1874.

[6]NISHINO K，YAMAGUCHI A.EvgA of the two-component signal transduction system modulates production of the yhiUV multidrug transporter inEscherichiacoli[J].JBacteriol，2002，184(8)：2319-2323.

[7]NISHINO K，YAMAGUCHI A.Overexpression of the response regulator evgA of the two-component signal transduction system modulates multidrug resistance conferred by multidrug resistance transporters[J].JBacteriol，2001，183(4)：1455-1458.

[8]NAGAKUBO K，NISHINO K，HIRATA T，et al.The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance ofEscherichiacolivia a novel multidrug exporter system，MdtABC[J].JBacteriol，2002，184(15)：4161-4167.

[9]NISHINO K，YAMADA J，HIRAKAWA H，et al.Roles of TolC-dependent multidrug transporters ofEscherichiacoliin resistance to β-lactams[J].AntimicrobAgentsChemother，2003，47(9)：3030-3033.

[10]NISHINO K，NIKAIDO E，YAMAGUCHI A.Regulation of multidrug efflux systems involved in multidrug and metal resistance ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium[J].JBacteriol，2007，189(24)：9066-9075.

[11]DATSENKO K A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J].ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(12)：6640-6645.

[12]DAVIS R W，BOLSTEIN D，ROTH J R.Advanced bacterial genetics[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1980：254.

[13]CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing，Twenty-second Informational Supplement，CLSI document M100-S22[S].Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

[14]CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals，Approved standard-Fourth Edition，CLSI document VET01-A4[S].Clinical and Laboratory Standards Institute，2013.

[15]SULAVIK M C，HOUSEWEART C，CRAMER C，et al.Antibiotic susceptibility profiles ofEscherichiacolistrains lacking multidrug efflux pump genes[J].AntimicrobAgentsChemother，2001，45(4)：1126-1136.[16]BAUCHERON S，IMBERECHTS H，CHASLUS-DANCLA E，et al.TheAcrBmultidrug transporter plays a major role in high-level fluoroquinolone resistance inSalmonellaentericaserovar typhimurium phage type DT204[J].MicrobDrugResist，2002，8(4)：281-289.

[17]孟春萍.鸭大肠杆菌acrB基因的缺失突变株构建及其相关功能研究[D].郑州：河南农业大学，2012.

MENG C P.Construction of theacrBgene deletion mutant from avianEscherichiacoliand some related biological functions[D].Zhengzhou：Henan Agricultural University，2012.(in Chinese)

[18]刘建华，苑丽，潘玉善，等.氨基糖苷类耐药鸭大肠杆菌acrD基因mRNA表达水平[J].中国兽医学报，2011，31(6)：814-818.

LIU J H，YUAN L，PAN Y S，et al.The expression ofacrDgene of aminoglycosides-resistant enteropathogenicE.coliisolated from duckling[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2011，31(6)：814-818.(in Chinese)

(编辑白永平)

Construction ofcpxRandacrBDouble Gene Deletion Strain ofSalmonellaentericaSerovar Typhimurium and Analysis of Its Susceptibility to Antibacterial Agents

HUANG Hui1，LIU Bao-guang1，SUN Ya-wei2，MA Cai-hui1，CHEN Li-peng1，YUAN Li1，PAN Yu-shan1，HU Gong-zheng1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453001，China)

Abstract:The aim of this study was to explore the role ofcpxRgene in the multidrug resistance ofSalmonellaentericaSerovar Typhimurium and exclude a possibility thatacrBmasks the effect ofcpxRon the other efflux pumps or outer membrane proteins.AacrBgene deletion strain JSΔacrBwas constructed by the method of one-step inactivation of chromosomal genes on basis of Red homologous recombination system.A double gene deletion strain JSΔacrBΔcpxR∷kanwas constructed by phage P22-mediated transduction with strain JSΔcpxR∷kanconstructed in the previous study as the donor and strain JSΔacrBas the recipient.Meanwhile，thecpxRcomplemental strain JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxRwas prepared through introducting the expression plasmid pBAD-CpxR into the double gene mutant.At last the minimal inhibitory concentrations(MICs) of 10 kinds of commonly used representative antibacterial agents for JS and the above strains constructed in this study were determined with broth microdilution method.The double gene deletion strain and relatedcpxRcomplemental strain were constructed successfully.Strain JSΔacrBshowed 32-，4-，4-，16-，32-，4-，2- and 128-fold decrease in the MICs of doxycycline，gentamycin，amikacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，florfenicol，ceftriaxone and ceftiofur respectively，compared to the parent strain JS.Strain JSΔacrBΔcpxR∷kanshowed 2-，8-，2- and 2-fold decrease in the MICs of doxycycline，gentamicin，amikacin，and ceftiofur compared to strain JSΔacrB.While the complemental strain JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxRshowed 4-，16-，2- and 4-fold increase in the MICs of the above four kinds of antibacterial agents compared to strain JSΔacrBΔcpxR∷kan.In conclusion，cpxRis able to regulate the antimicrobial susceptibility ofS.entericaSerovar Typhimurium to doxycycline，gentamicin，amikacin，and ceftiofur.

Key words:S.entericaSerovar Typhimurium；cpxR;acrB；double gene deletion；minimal inhibitory concentration(MIC)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.024

收稿日期：2015-06-09

基金项目：国家自然科学基金(31372481)

作者简介：黄慧(1988-)，女，河南罗山人，博士生，主要从事抗感染药物药理及细菌耐药性研究，E-mail：hhcshwj@126.com *通信作者：胡功政，教授，E-mail：yaolilab@163.com

中图分类号：S852.612

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)03-0595-08