促排卵药雷洛昔芬对小鼠着床窗期子宫内膜COX-2 和LPAR3表达的影响

冼英杰　陈彩蓉　周秀琴　颜秋霞　梁小青　赵晓英



促排卵药雷洛昔芬对小鼠着床窗期子宫内膜COX-2 和LPAR3表达的影响

冼英杰★陈彩蓉周秀琴颜秋霞梁小青赵晓英

［摘要］目的通过分析新促排卵药雷洛昔芬（raloxifene，RAL）对着床窗期小鼠子宫内膜容受性标志物环氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）和溶血磷脂酸受体 3（lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）表达的影响，探讨雷洛昔芬是否损害小鼠子宫内膜容受性。方法雌性昆明系小鼠60只，随机分为RAL用药促排卵组和自然受孕对照组。在雌鼠妊娠第4.5 d，采用免疫组化法检测COX-2和LPAR3在2组雌鼠子宫内膜中的表达。结果COX-2、LPAR3 2个因子在RAL用药组和自然受孕对照组小鼠中的表达均无显著性差异，P＞0.05。结论通过RAL用药来进行促排卵，对着床期小鼠子宫内膜COX-2和LPAR3表达水平的影响不明显，对子宫内膜容受性未发现产生不良损伤。

［关键词］雷洛昔芬；环氧合酶2；溶血磷脂酸受体3；表达

★通讯作者：冼英杰，Email：xian2379180@126.com

伴随着社会、生活和环境的变化，不孕不育已成为困扰部分人群的烦恼问题。近年来，体外受精-胚胎移植技术（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）得到快速发展与临床应用［1］。它是指分别将卵子与精子从人体内取出进行体外受精，形成胚胎后再移植回母体子宫，让其继续发育至出生的一种辅助生殖技术。而成功实施该项技术有2个关键，一是通过控制性促排卵得到高质量的卵子，通过体外受精形成优质胚胎；另一关键是子宫内膜拥有良好的容受性，使胚胎能够成功植入，获得临床妊娠［2］。目前如克罗米芬（clomiphene citrate，CC）等常用的促排卵药，在临床上取得了很好的促排卵效果，但也均被发现会出现一些副作用，如影响子宫的容受性及精卵的种植效果等，导致低妊娠率［3-4］。

雷洛昔芬（raloxifene，RAL）为第2代选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulator，SERM），已获得了美国食品与药品管理局的许可，成为治疗绝经后妇女骨质疏松症和浸润性乳腺癌的新药［5］。日前，RAL被发现具有与传统药物克罗米芬具有相似的促排卵功效，但该药的促排卵应用在在国内外尚处于初步探索阶段，它对子宫内膜容受性的影响在国际上尚无定论［6］。据研究发现，子宫内膜分子标志物如环氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）和溶血磷脂酸受体3（lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）的表达水平能很好地反映子宫内膜的容受性状况［7-8］。本研究拟通过检测RAL用药对受孕小鼠着床窗期子宫内膜因子COX-2和LPAR3表达的变化，来探讨RAL对子宫内膜容受性的影响，从而为RAL在临床促排卵治疗中的应用提供依据。

1　材料与方法

1.1研究对象

选取由广东省实验动物中心提供的6周龄、体重20～24 g、未曾受孕的昆明系白小鼠90只（其中雌鼠60只、雄鼠30只），随机将雌鼠分成RAL给药促排卵组和自然周期正常对照组，每组30只雌鼠。让小鼠在环境温度25±5℃、相对湿度60%～80%、控光（每天于8：00～20：00间光照12 h）条件下，自由摄食和饮水。

1.2材料与方法

1.2.1动物给药方法

每天上午8：30～9：00在雌鼠的第3个动情周期前期，对其进行灌胃。对于给药组的小鼠，用l mL含0.97 mg/mL RAL（购自礼来苏州制药有限公司，规格为60 mg×7片装/盒）的生理盐水溶液灌胃，每天给一次，连续2天。对于正常对照组的小鼠，用l mL不含药物的生理盐水灌胃。

1.2.2子宫内膜标本获取

2天（即2次用药）后的下午17：00，分别往每只雌鼠腹腔注射5单位的人绒膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）来诱发排卵，按雌雄1∶1合笼。次晨7：00发现阴道栓者即定为妊娠第l d，计为Dl；在D4.5时，采用脱臼法处死各组雌鼠，分离子宫。子宫内膜用10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋，制成蜡块切片。

1.2.3免疫组化检测

用免疫组化法检测子宫内膜组织中LPAR3和C0X-2蛋白表达水平。石蜡块切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温处理10 min，蒸馏水洗涤3次；热修复抗原，PBS洗涤2次。室温封闭30 min后，分别加入兔抗COX-2抗体（ab52237，购于Abcam公司）、兔抗LPAR3抗体（ab75732，购于Abcam公司），4℃孵育过夜，PBS洗涤3次；加入相应的二抗，37℃30 min，PBS液冲洗3次；然后用DAB显色，充分水洗；苏木素复染后，脱水，透明，封片。组织切片染色情况由2位高年资病理医师采用双盲法进行评判。每例切片均选择10个高倍视野，腺上皮细胞中呈棕黄色颗粒为阳性表达；根据细胞的染色强度，把全部切片的染色结果评定为-（浅蓝色）、+（浅黄色）、++（棕黄色）、+++（棕褐色），如图1。

1.3统计分析

采用SPSS17.0统计分析软件进行数据分析。两组间计数资料的比较采用χ2检验，以双侧α= 0.05为检验水准。

2　结果

免疫组化结果显示，COX-2与LPAR3均主要分布于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中；而且，在着床窗期，RAL用药组与正常对照组雌鼠子宫内膜腺上皮的COX-2表达水平没有显著的差异（P＞0.05）；两组雌鼠子宫内膜腺上皮LPAR3的表达水平也差别不明显（P＞0.05），见图1与表1。

3　讨论

在过去的50多年中，CC一直是促排卵治疗的一线药物。它是一种SERM，具有弱的雌激素作用，通过阻断下丘脑和垂体上的雌激素受体部位的负反馈抑制而刺激垂体促性腺激素的分泌，从而诱导卵泡的发育和排卵；但另一方面，CC也会对子宫和宫颈产生抗雌激素的副作用，进而导致子宫内膜过薄及宫颈粘液粘稠，对子宫内膜容受性具有抑制作用，导致其高排卵率和低妊娠率［9-10］。

RAL属于第2代SERM，已被用于治疗绝经后妇女骨质疏松症，并可降低浸润性乳腺癌的发病风险［11］。已有研究表明，RAL也通过竞争性结合下丘脑雌激素受体，抑制雌激素对下丘脑的负反馈作用，促进内源性卵泡刺激素和黄体生成素的释放及卵泡生长［12］。而在体外细胞实验中，RAL表现为雌激素拮抗作用或中立作用［13］。RAL的半衰期（32.5 h）较短，经口服后绝大部分体内的RAL及其代谢物在5 d内排出，对子宫内膜增殖的影响有限；至胚胎着床期，RAL已被清除干净，在促排卵治疗中对子宫内膜的影响不大。

信使因子COX-2是花生四烯酸合成前列腺素的关键酶，而前列腺素在胚胎着床、生长发育过程中起重要作用。因此，COX-2可通过影响前列腺素的合成调节女性生殖功能。COX-2基因缺陷的雌性小鼠会出现多方面的生殖功能障碍，如排卵障碍、卵子受精率下降、胚胎着床及子宫蜕膜化障碍等［7］。LPAR3是一种G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCR），通过结合溶血磷脂酸在哺乳动物生殖过程中发挥重要作用，与胚胎植入功能密切相关［14］。而且，LPAR3基因缺陷的小鼠与临床表现与COX-2基因缺陷的小鼠类似。敲除LPAR3基因的小鼠，COX-2的表达也显著降低。LPAR3还可能通过COX-2-前列腺素途径来影响胚胎的着床。因此，COX-2与LPAR3是2个预测子宫内膜容受性的良好参考指标［7，14］。本研究发现，COX-2、LPAR3 2个因子标志物在RAL用药组和自然受孕对照组小鼠中的表达均无显著性差异。这提示使用RAL进行促排卵治疗并未降低着床窗期小鼠子宫内膜的COX-2和LPAR3表达，对子宫内膜容受性未产生明显损害。最近也有研究发现，RAL对子宫内膜的厚度也没有不良损伤［15］。因此，RAL是一种温和、安全、有效的促排卵新药。当然，使用RAL进行促排卵的应用研究在国内外生殖医学领域刚刚起步，尚处于摸索阶段，有待通过更广泛的临床研究及更深入的药效机制来加以探讨。

表1　不同组雌鼠着床窗期子宫内膜的COX-2、LPAR3表达情况比较Table 1　Comparison of the expression of COX-2 and LPAR3 in endometrium of female mice during periimplantation in different groups

参考文献

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Effects of ovulation induction by raloxifene treatment on the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse uterine endometrium during periimplantation period

XIAN Yingjie★，CHEN Cairong，ZHOU Xiuqin，YAN Qiuxia，LIANG Xiaoqing，ZHAO Xiaoying
（Reproductive Medicine Center，People’s Hospital of Qingyuan，Qianyuan，Guangdong，China，511500）

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the effect of ovulation induction by raloxifene treatment on endometrial receptivity by detection of the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium during peri -implantation period.Methods60 female non-pregnant Kunming mice were randomly divided into the RAL treatment group and the normal control group（natural conception）.4.5 days following pregnancy，the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium was detected by immunohistochemical staining. ResultsThere were no significant differences in the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium between the RAL group and the normal controlled group.ConclusionRaloxifene treatment for ovulation induction does not change the expression of COX-2 and LPAR3 in mouse endometrium significantly，and has no harmful effects on the endometrial receptivity.

［KEY WORDS］Raloxifene（RAL）； Cycloxygenase-2（COX-2）； Lysophosphatidic acid receptor 3 （LPAR3）； Expression

基金项目：清远市科技计划项目（2013B015）

作者单位：清远市人民医院生殖医学中心，广东，清远511500