EB病毒感染的核酸检测：标本类型的选择

郭建巍



·述评·

EB病毒感染的核酸检测：标本类型的选择

郭建巍★

［摘要］近年来的研究表明，EB病毒（epstein-barr virus，EBV）感染与多种疾病的发生有密切的关系。由于EB病毒独特的感染方式，其实验室诊断特别是核酸检测显得尤为重要。本文就EB病毒的生物学特性、感染方式、抗体产生，特别是核酸检测中标本类型的选择、标准化以及未来的检测方向等问题进行了述评和展望，以期为EB病毒感染相关疾病的诊断和预后评判提供更准确的核酸检测结果。

［关键词］EB病毒；标本；血浆；外周血单个核细胞

★通讯作者：郭建巍，E-mail：jwkuo@sohu.com

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）即人类疱疹病毒Ⅳ型（human herpesvirus type 4），是一种常见的人类疱疹病毒。EBV初次感染后就终生定居在B细胞中。据文献报道，约90%以上的成人EB病毒血清学反应阳性，提示在儿童或青少年时感染过EB病毒［1］。

近年来大量研究证明，EBV与人群鼻咽癌、何杰金病、T/NK细胞淋巴瘤（T/Natural killer cell lymphoma）、Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤发生、发展相关，还与免疫抑制剂使用患者和多种免疫缺陷性疾病患者移植后淋巴细胞增殖性异常（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）、移植后平滑肌肿瘤、获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）相关性淋巴瘤、多发性硬化、原发性中枢神经系统淋巴瘤或平滑肌肉瘤密切相关［2-7］。由于EBV广泛的疾病谱，EBV已成为许多学者研究和关注的焦点。

在EBV感染的临床诊断中，临床医生必须要弄清楚几个问题：患者是否感染EBV？EBV感染处于什么时相？是否为EBV的活动性感染？所患疾病是否与EBV感染相关？只有弄清楚了这几个问题，才能对EBV相关疾病的诊疗有一个全面而整体的认识，才好有的放矢、对症治疗。而要回答这些问题，就必须要了解EBV的生物学特性及其特殊的感染形式。本文就EBV生物学特性及感染方式、EBV感染类型及免疫相关指标、感染后的实验诊断指标、核酸检测标本类型的选择、标准化等问题进行讨论，以期为EBV感染相关疾病的诊断和预后评判提供科学依据（表1）［8］。

表1　EBV相关性疾病核酸检测建议使用的标本类型［8］Table 1　Suitable type of specimens preferred in nucleic acid detections in different epstein-barr virus-associated diseases［8］

1　EBV生物学特性及感染方式

EBV是线性双链嗜B细胞DNA病毒，基因组长172 kb，包括编码衣壳抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）和核抗原（nuclear antigen，NA）的基因。EBV基因组大部分是相同的，在编码EBV核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA）2，EBNA 3A，EBNA 3B及EBNA 3C的基因亚型中存在一些等位基因多态性的亚型，Ⅰ型在西方国家和东南亚居多，非洲地区Ⅰ型和Ⅱ型同时存在。

人是EBV感染的惟一宿主，由于B细胞表面有EBV受体分化群抗原21（cluster of differentiation antigen，CD21）分子，EBV能直接感染侵入B细胞并使其永生化，或以郎罕氏细胞介导的方式感染口咽部上皮细胞，入血后再感染B淋巴细胞。由于绝大多数上皮细胞缺少CD21分子，EBV侵入上皮细胞的机制要比侵入B细胞复杂。一般认为EBV原发性感染发生在口腔，口咽部上皮细胞和B细胞为EBV主要宿主细胞，EBV也可感染T细胞、NK细胞、平滑肌细胞和滤泡树突状细胞等。根据EBV感染时间和EBV感染后产生的特异性抗体谱，可将EBV的感染分为原发感染、潜伏和激活3种类型。

EBV通过病毒包膜糖蛋白gp350与B细胞表面CD21分子结合，接着EBV gp42与B细胞上人白细胞抗原Ⅱ类分子（human leucocyte antigenⅡ，HLA-Ⅱ）结合而促进膜融合，EBV进入B细胞并扩增，表达病毒特异性抗原分子，诱导机体免疫应答，活化NK细胞，诱导产生EBV特异性细胞毒T细胞（EBV-specific cytotoxic T lymphocytes，CTL），抑制并最终清除EBV阳性B细胞。EBV原发感染消退快，仅于部分记忆性B细胞内建立持续甚至终身性潜伏，因此传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）［9］一般呈良性自限性，IM发病过程是机体免疫控制EBV的结果。急性感染痊愈后的个体内有百万分之一的B细胞会携带有EBV基因组，这也是EBV感染的一个重要特性。

2　EBV感染类型及免疫相关指标

EBV原发感染后，体内首先出现EBV衣壳抗原特异性 IgM 抗体（viral capsid antigen IgM antibody，VCA-IgM），随后出现EBV衣壳抗原特异性IgG抗体（viral capsid antigen IgM antibody，VCA-IgG），急性感染的晚期出现抗早期抗原（early angtigen，EA）抗体，而EBNA IgG抗体阴性。

在潜伏期，多数细胞中的EBV基因组处于潜伏状态，此时细胞只合成EBNA、EB病毒编码的小RNA（EBV encoded small RNA，EBER）和潜伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括EBNA 1-2，EBNA 3A-3C，EBER1，EBER2，LMP1及LMP2A。处于潜伏期的EBV并不复制，绝大多数存在于记忆性B细胞上，被感染的记忆性B细胞进入外周血循环时血中可检测到病毒。目前认为有5种EBV感染类型，即溶解型、0型、Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同的感染类型与不同的临床疾病密切相关。在溶解型中，被感染的细胞为淋巴组织中的浆细胞，浆细胞被感染后，EBV在浆细胞中复制，表达溶解基因，导致EBV复活，最后导致细胞的溶解；0型指EBV感染处于潜伏状态，被感染的细胞为外周血记忆细胞，处于0型感染的EBV在患者体内终生存在，此型感染属于EBV健康携带者；在Ⅰ型潜伏感染中，被感染的细胞为外周血记忆细胞，主要见于Burkitt淋巴瘤细胞，EBNA只表达EBNA1基因；在Ⅱ型潜伏感染中，被感染的细胞为淋巴组织中的生发中心细胞，Ⅱ型潜伏感染与鼻咽癌、NK细胞淋巴瘤和何杰金病有关，此时病毒处于沉默期，被感染细胞中出现EBNA1及LMP1/2A等病毒产物；在Ⅲ型潜伏感染中，被感染细胞为淋巴组织中的幼稚细胞，表达EBNA1，EBNA2，EBNA3A-C，EBNA-LP，LMP1，LMP2A+B等基因，活化B细胞，在急性传染性单核细胞增多或移植后淋巴细胞增生性异常患者中可观察到Ⅲ型潜伏感染。

EBV原发感染4～6个月后体内检测到的抗体主要为IgG型抗体，代表性抗体为VCA-IgG和EBNA-IgG［10］，EBV既往感染表明曾经发生EBV感染，但目前无活动性EBV感染的临床表现和实验室证据。免疫功能正常，EBNA-IgG抗体阳性者如EA抗体滴度显著高，一般表明存在EBV感染激活或再燃。EBV原发感染后，部分感染者特异性EA抗体可能持续数年而并无临床症状，因此，是否存在活动性EBV感染相关临床表现也是诊断EBV感染激活的重要依据。此时如果动态检测血液中的EBV核酸将对疾病的诊断及转归判断提供重要依据。

3　EBV感染后的实验诊断指标

可以说机体的免疫功能状况是决定EBV潜伏感染状态和EBV相关疾病发生乃至发展的重要因素。被感染的B细胞偶尔会受到刺激而重新激活，激活的病毒可再感染新的B细胞和上皮细胞，使处于潜伏状态下的EBV再次激活并大量复制，导致IM症状持续存在或退而复现称为慢性活动性EBV感染（chronic active EBV infection，CAEBV）。EBV感染T/NK细胞并造成其克隆性增生且不能产生足够的CTL可能是其发病的主要原因。目前对病毒再激活的分子机制目前仍无清晰的认识。深入了解每种基因产物在EBV相关疾病发病中作用会帮助临床医生制定出更多合理、有效的预防及治疗策略。

目前常用的用于EBV感染的实验室指标有嗜异性抗体检测、血液细胞分析即血常规、异型淋巴细胞分型、EBV特异性抗体检测及分型、EB病毒核酸定量和EBER原位杂交。EBER已成为组织和细胞中EBV检测的金标准，并广泛应用于临床病理学诊断。荧光定量PCR（fluorescent quantita-tive polymerase chain reaction，FQ-PCR）可用于定量检测体液及组织样本中的EBV拷贝数，特别适用于移植病人EBV相关疾病的感染监测；通过检测脑脊髓液中的EBV核酸可诊断中枢神经系统是否有EBV感染；对非典型临床症状患者或嗜异凝集试验阴性的IM幼儿通过EBV核酸定量可做出实验室诊断；通过EBV核酸定量可评价抗EBV治疗的疗效；检测血浆中EBV核酸水平对鼻咽癌的的诊断、转移、复发和预后判断均有重要意义［10］。

4　EBV核酸检测标本类型的选择

关于血液中EBV检测标本类型的选择有许多争议，其焦点来源于EBV在血浆中拷贝数比在全血样本中的拷贝数低10～100倍，因此多数人还是倾向于全血。近年来，荧光定量PCR已广泛应用于EBV感染的实验室诊断［11］，也是EBV核酸定量的金标准，目前至少有10种不同的荧光定量PCR商用试剂在中国、美国和欧洲等国家和地区使用［12］，除在鼻咽癌的诊断中EBV DNA有一定的缺陷外，在其他感染性疾病的诊断中均发挥了重要的作用。

一般来说，外周血中的EBV DNA可以溶解的线型或游离循环DNA形式出现，线型的DNA在EBV重新活化、伴随着宿主细胞溶解和产生病毒体时均可在血液中检测到，游离的DNA在潜伏感染的B细胞中也可检测到。此外，凋亡的肿瘤细胞释放的裸露的无细胞EBV DNA也可在外周血中检测到。在EBV重新激活时释放病毒，此时要检测血清或血浆，因为其包含与细胞无关的DNA，如果要检测全血中与细胞相关DNA的话要选择外周血单个核细胞或B细胞作为首选标本。

关于在荧光定量PCR检测中如何选择合适的标本，表1根据不同疾病列出了EBV核酸定量中可供临床选择的适宜标本类型［8］。表中对各类疾病中最合适的标本类型进行了推荐，但由于EBV的特殊性，在EBV相关疾病的检测中标本选择目前仍不能做到唯一和绝对。通常情况下，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中的EBV载量检测更加精确，因为它是B细胞的在血液中停留的重要地方。对移植患者，检测全血中EBV的核酸定量与PBMC中核酸定量同样有效，这样就可以避免了核酸定量检测中由于提取PBMC产生的花费与更长等待时间。也许这个模式也可用于其它EBV相关疾病的核酸检测中，如鼻咽癌、T/NK细胞淋巴瘤、何杰金病、B细胞非何杰金淋巴瘤（B cell non-hodgkin lymphomas，B-NHL），因为这些疾病中病毒并不能从凋亡的肿瘤细胞中释放出来，而这些疾病目前还推荐用血浆进行EBV核酸的定量检测。对移植相关疾病，EBV的核酸定量显得非常必要，为提高检测的敏感性和特异性，对PTLD病人还要结合EBV特异性细胞免疫来进行综合判断［13-15］，这对区别PTLD复发和区分EBV感染后的慢性高病毒载量（chronic high viral loads，CHVL）具有重要意义。目前的临床实践中我们更倾向于使用PBMC和血浆中的EBV核酸定量结果来指导临床诊疗［16］，从这2种类型标本的检测结果还可以推算出全血中的EBV浓度，因此具有更高的实用价值。

5　EBV核酸检测的标准化

在荧光定量PCR检测EBV核酸定量中，还有一个亟待解决的重要问题就是定量的标准化。目前评估病毒载量的单位有全血和血浆中copies/ mL、DNA中copies/μg和copies/每个细胞，国内大多数实验室用全血和血浆中IU/mL、copies/mL来表示。如果统一使用国际单位及标准，就可使实验室内部的比较更加有效，疾病的诊断、预后判断及预先治疗就有了统一的标准。虽然有许多学者在这方面做了大量工作，并成立了专门的国际组织，但由于不同的厂家使用的EBV靶序列区域不同、引物和探针不同，导致扩增的效率也不同；此外，不同EBV基因组中重复序列不同，不同EBV相关疾病中EBV表达方式也不同，因此EBV核酸定量的标准化仍有一定的难度［17］。为了保证精确的定量，有学者推荐在核酸定量中设计引物和探针时，要使用EBV中的单个高度保守区域，不建议使用BamHI-W区域，如EBNA1和BALF-5基因的BamHI-K区域［18］。从2015年开始卫生部临床检验中心增加了巨细胞病毒核酸检测的室间质评工作，明确以IU/mL作为结果的表示方法。提示卫生部临床检验中心对国内临床实验室EBV核酸检测的质量控制及标准化监管指日可待。

6　EBV核酸检测的展望

未来EBV的核酸定量中将会增加数字PCR技术［19］。数字PCR通过计数单个分子从而实现绝对定量，它采用直接计数目标分子数而不依靠任何校准物及内标与外标，更容易实现检测中的质量控制和标准化。数字PCR在进行扩增反应前，将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到独立反应室，在微流控芯片上单分子间通过稀释分离，独自进行PCR扩增，最后分析每个扩增产物。数字PCR操作方便、特异性强、灵敏度高、检测通量高，已成为分子生物学研究中的重要手段。与传统荧光定量PCR相比，除检测范围较窄的缺点外，数字PCR更加精确，可以检测更低拷贝数的目标DNA分子，同时还可以研究基因序列的变化，可为下一代测序定向克隆扩增出样本中的DNA分子，并实现病毒分子的绝对定量。在EBV的核酸检测中如果将数字PCR技术和荧光定量PCR技术配合使用，可以扬长避短，必将为EBV相关疾病的临床诊断提供更加准确和可靠的实验室结果。

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What kind of specimen is used for epstein-barr virus nucleic acid detection

GUO Jianwei★
（Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing，China，100048）

［ABSTRACT］In recent years，many researchers have demonstrated that epstein-barr virus（EBV）infections are associated with a broad spectrum of diseases.Due to the unique mode of infection by EBV，nucleic acid detection appears to be particularly important.In this review article，the biological characteristics，infection modes，and production of antibodies of epstein-barr virus will be discussed，as well as the suitable type of specimens，standardization and future development direction of nucleic acid detection methods in an effort to supply more accurate results for diagnosis and prognostic evaluation of EBV-associated diseases.

［KEY WORDS］Epstein-barr virus；Specimen；Plasma；Peripheral blood mononuclear cells

作者单位：海军总医院检验科，北京100048