miR-196a2基因多态性在广西人群中的分布

罗宏成　温旺荣　李珉珉　韦颖　谭昙　韦叶生★



miR-196a2基因多态性在广西人群中的分布

罗宏成1温旺荣1李珉珉1韦颖2谭昙2韦叶生2★

［摘要］目的探讨广西人群miR-196a2 T＞C（rs11614913）等位基因及基因型频率分布情况，分析其与不同民族种族之间的差异性。方法利用单碱基延伸PCR技术（polymerase chain reactionsingle base extension，PCR-SBE）和DNA测序技术，检测303例广西人群中miR-196a2 T＞C的基因型，并比较其与人类基因组计划（human genome project，Hapmap）数据库中公布的非洲人、欧洲人、日本人和中国北京人群的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）数据，揭示这5个不同民族种族人群的等位基因及基因型频率分布规律。结果miR-196a2T＞C等位基因和基因型频率在广西男女间分布无差异性（P＞0.05）。广西人群miR-196a2 T＞C多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、日本人比较有统计学差异意义（P＜0.05），但与北京人群无差异性（P均＞0.05）。结论广西人群miR-196a2T＞C存在基因多态性，与别的民族种族人群比较有明显的差异性，这种差异性对于基因组水平上疾病的研究可能会起到积极重要作用。

［关键词］miR-196a2；单核苷酸多态性；种族

★通讯作者：韦叶生，E-mail：wysh22@163.com

微小核糖核酸（miRNAs）是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA。miRNAs主要通过部分互补结合到目的基因信使RNA（mRNA）的3′非编码区（3′UTRs），部分降解靶基因或者抑制其翻译表达［1］。miRNAs参与细胞增殖、分化、发育、凋亡、胰岛素分泌、肿瘤发生发展过程等多种生物学行为［2-5］。前体miRNAs （pre-miRNAs）可以影响成熟miRNAs的形成和表达水平，从而可能影响疾病的发展和归化。最近存在前体miRNAs的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）序列（miR-196a2T＞C ［rs11614913；chromosome 12，54385599］）被发现参与多种疾病的发病机制［6-8］。目前有关广西人群分布miR-196a2基因多态性在与疾病之间易感性未见报道。因此本文运用单碱基延伸PCR和DNA基因测序技术对303例广西人群miR-196a2基因型进行检测研究，为研究广西人群SNP与疾病易感性提供理论知识基础，也为深入认识miR-196a2基因在人类疾病发病机制的研究提供理论依据。

1　对象与方法

1.1研究对象

随机选择2014年1月至2015年12月到右江民族医学院附属医院体检的无血缘关系健康人群303例，其中男性181例，女性122例，年龄21～86岁，平均年龄57±0.68岁。临床实验室各检查指标均正常，排除严重感染、心脑血管疾病及肿瘤的体检者。

1.2实验方法

1.2.1DNA提取

抽取健康体检者静脉血3 mL于含EDTA-K2抗凝的管中；采用亚能生物技术（深圳）有限公司全血DNA提取试剂盒，严格按照说明书提取全血基因组DNA，-70℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成

根据NCBI中Genebank基因库包含人miR-196a2 T＞C（rs11614913）SNP位点的全长序列，用在线软件primer3.0设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-196a2 T＞C （rs11614913）上游引物序列：5′-CCCCTTCCCTT CTCCTCCAGAT-3′，下游引物序列为：5′-TTGTTCTGCAACCCCACTCACA-3′，延伸引物序列：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTG-3′。

1.2.3PCR扩增

miR-196a2 T＞C（rs11614913）位点的PCR扩增标准反应体系20 μL体系包含有PCR缓冲液1x GC buffer I（TAKARA，宝生物工程（大连）有限公司）2 μL，0.2 mmol/L dNTP 2.0 μL（GENERAY BIOTECH，上海捷瑞生物工程有限公司），0.2 μmol/L上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μL，若体积不足20 μL用灭菌双蒸水补足。PCR产物用德国Qiagen公司的Hot-StarTaq进行多重PCR获得，8 μL的PCR产物经0.5U虾碱酶（SAP）（Promega，美国）和4U外切酶I （EXO I）（Epicentre，美国）纯化后，再用美国ABI公司的SNaPshot Multiplex kit技术于37℃孵育60 min，紧接着75℃孵育15 min进行延伸反应，延伸产物用虾碱酶（SAP）（Promega，美国）纯化后用美国ABI3730XL测序仪电泳测序。SNP分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems，美国）来分析。PCR反应参数为：95℃预变性2 min；扩增阶段为：94℃预变性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min，循环11次；94℃预变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环24次；最后阶段72℃延长2 min。

1.3统计学分析

实验数据用SPSS 13.0统计软件包进行分析，基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，采用χ2检验比较各组间基因型及等位基因频率，以P＜0.05有统计学意义。

2　实验结果

2.1miR-196a2 T＜C基因型检测结果

miR-196a2 T＜C基因均具有多态性，其PCR扩增产物的片段大小为：276 bp。miR-196a2 T＜C基因有CC、CT、TT 3种基因型。基因测序仪ABI3730测序证实了我们的检测结果，结果见图1。

2.2miR-196a2 T＞C基因多态性在广西健康人群中的分布

miR-196a2 T＞C基因型和等位基因频率，经χ2检验，所有基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，样本来源具有群体代表性。miR-196a2多态性位点基因型和等位基因频率在广西人群男女之间比较均无统计学差异（χ2分别为0.119和0.023，P值分别为0.942和0.879，P均大于0.05），miR-196a2 T＞C基因以CT杂合子基因型多见，占52.5%，等位基因T多见，占51.0%，结果见表1。

表1　广西人群miR-196a2 T＞C（rs11614913）基因型和等位基因频率分布比较Table 1　The distribution of allele and genotype frequences of miR-196a2 T＞C（rs11614913）gene in Guangxi population

2.3miR-196a2 T＞C基因在不同种族人群间的比较

miR-196a2 T＞C基因多态性分布频率分别与人类基因组计划公布（human genome project，Hap-Map）公布非洲人、欧洲人、日本人和中国北京人4个人群的SNP分型数据进行比较。广西人群miR-196a2 T＞C多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、日本人比较有统计学差异意义（χ2分别为141.34、7.73、8.43和148.23、4.45、6.64；P均小于0.05），但与中国北京人比较差异无统计学意义（χ2分别1.91和0.05；P均大于0.05），见表2。

3　讨论

miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA（前体miRNA），长度大约为300～1 000个碱基，pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即miRNA前体，长度大约为70～90个碱基，pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24核苷酸（nucleotide，nt）的成熟miRNA。每个miRNA可能有多个靶基因，而几个miRNA也可同时调节同一个靶基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。miRNA调节着人类三分之一的基因，备受科学研究人员的关注。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。越来越多的研究表明，存在于前体miRNA的SNP会影响成熟miRNA的表达水平以及人类疾病易感性［9-10］。最近很多研究表明，miR-196a2 T＞C （rs11614913）基因多态性与许多疾病的易感性有关，miR-196a2（rs11614913）与北印度人乳腺癌、肺癌等风险性密切相关［11-12］，miR-196a2基因多态性会改变成熟miR-196a2的表达量而引起非霍奇金淋巴瘤［13］。刁吉东等［14］研究认为miR-196a2内的SNP rs11614913与中国皖南地区汉族人群支气管哮喘的发生有相关性。肖茗渊等［15］研究发现miR-196a2（rs11614913）与中国华东地区人群系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）遗传易感性有关。miR-196a2基因多态性通过结合到其同源异型基因C8（HOXC8）靶基因就会增加中国儿童患急性淋巴细胞白血病的危险［16］。因此，深入分析miR-196a2基因多态性在不同民族种族的分布规律，有利于我们运用基因多态性去认识和解释更多疾病在不同种族民族人群中的发病率和发病机制。

表2　不同地区民族及种族miR-196a2 T＞C（rs11614913）基因多态性频率分布比较Table 2 The comparison of frequency distribution of miR-196a2 T＞C（rs11614913）gene Polymorphism among different ethnic and regional groups

本文采用单碱基延伸PCR技术和DNA测序技术对303例广西健康人群miR-196a2基因多态性进行研究，统计其各自基因型和等位基因分布情况。分析结果表明miR-196a2均存在基因多态性，miR-196a2 T＞C（rs11614913）存在CC、CT、TT 3种基因型。miR-196a2 T＞C（rs11614913）以CT杂合子多见，占52.5%，等位基因T多见，占51.0%，miR-196a CT（52.5%）均高于非洲人（25.7%）、欧洲人（44.2%）、日本人（45.3%）、北京人（44.2%），原因可能是miR-196a基因多态性受各民族生活习惯及环境影响。miR-196a2基因在广西健康男女人群中基因型和等位基因分布均无差异（χ2分别为（0.269和0.023，P均＞0.05）。miR-196a2 T＞C多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、日本人比较有统计学差异意义（χ2分别为141.34、7.73、8.43和148.23、4.45、6.64；P均小于0.05），但与中国北京人群无统计学差异（χ2分别为1.910 和0.050，P均大于0.05），与人类遗传学有关人类亲缘关系越近，其基因型分布规律相似程度越高相符合。

以上研究表明，广西健康人群miR-196a2基因型及等位基因与其他民族种族存在差异性，正确分析其基因型在不同地区人群的分布特点，为今后更深一步研究miR-196a2基因多态性在不同民族种族人群相关疾病的发病机制以及疾病的防治提供科学有效途径，也为人类群体遗传学研究奠定基础。

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Distribution of genetic polymorphism of miR-196a2 gene in Guangxi population

LUO Hongcheng1，WEN Wangrong1，LI Minmin1，WEI Ying2，TAN Tan2，WEI Yesheng2★
（1.Department of Laboratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou，Guangdong，China，510632；2.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000）

［ABSTRACT］ObjectiveTo study the frequencies of allele and genotype distribution of miR-196a2 T＜C（rs11614913）gene，and to analyze the statistical differences between different races and nationalities. MethodsThe gene of single nucleotide polymorphisms（SNP）miR-196a2T＜C were detected using polymerase chain reaction-single base extension（PCR-SBE）technique and DNA sequencing methods in 303 Chinese Guangxi populations，and compared with differences SNPs date among the European，African，Japanese and Chinese populations in Beijing from the human genome project（HapMap），and the distribution of allele and genotype frequencies of 5 nationalities were revealed.ResultsThere were no statistical differences of allele and genotype distribution in miR-196a2T＜C between female and male group（P＞0.05）. There were significantly different frequencies of allele and genotype distributions of miR-196a2 T＜C when compared with Europeans，Africans and Japanese，but no statistical differences when compared with Chinese in Beijing from China.ConclusionThere were significant differences in allele frequencies and genotype distributions of the gene polymorphism miR-196a2T＜C when compared with other racial and nationalities，and this difference in genome level may play a positive role in the research of disease.

［KEY WORDS］miR-196a2；single nucleotide polymorphisms（SNP）；Ethnic

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81560552，81060243）

作者单位：1.暨南大学第一临床医学院检验科，广东，广州510632 2.右江民族医学院附属医院检验科，广西，百色533000