大豆硒蛋白构象的光谱法研究

胡 勇，吴小勇，钟南京，徐金瑞

广东药科大学食品科学学院，广东 中山 528458

大豆硒蛋白构象的光谱法研究

胡 勇，吴小勇*，钟南京，徐金瑞

广东药科大学食品科学学院，广东 中山 528458

采用荧光光谱、紫外光谱并结合红外光谱对比研究了大豆硒蛋白和大豆蛋白的结构区别，并用荧光相图法分析了脲诱导下两种蛋白的去折叠过程。考察了温度、pH值对大豆硒蛋白质构象的影响，同时对其乳化稳定性能进行了测定。结果表明，与大豆分离蛋白相比，大豆硒蛋白分子中的共价二硫键受到破坏，分子内氢键作用减弱，疏水相互作用增强，蛋白质分子发生伸展。大豆硒蛋白在溶液中只呈现“折叠”和“松散”两种状态，与大豆蛋白相比更容易被水解变性。升高温度，大豆硒蛋白溶液存在明显荧光热猝灭效应，疏水性逐渐增强，蛋白质分子趋于折叠。在pH值2.8～8.0的范围内，大豆硒蛋白的Trp残基主要分布于其分子外部的极性环境中，并随pH值变化在等电点两侧呈现不同的构象变化。在酸性环境中大豆硒蛋白较易发生从松散到折叠的构象转变，碱性条件则较有利于大豆硒蛋白以松散的结构存在。此外，基于紫外光谱数据分析了大豆硒蛋白乳化特性，结果表明降低温度有利于增强大豆硒蛋白的乳化性能，但使其稳定性能下降。

大豆硒蛋白；构象；光谱

引 言

硒是人体必需的微量元素之一，适当的硒补充对于维护人体健康是非常重要的。许多数据表明，改善硒的摄入状况，对居民长远的健康有益，特别是可以降低居民罹患癌症的风险[1]。硒在人体及动物体内主要以硒蛋白的形式表现生物学功能。大豆硒蛋白是将大豆蛋白与硒元素有机整合到一起的一种新的蛋白质资源，硒元素的加入, 进一步增强了其生物学研究价值[2]。与无机硒相比，富硒蛋白吸收利用率高，生物活性强，具有更好的抗癌、抗肿瘤等药理作用。如大豆硒蛋白可显著提高抗氧化酶的活性、促进免疫器官发育、增强免疫调节能力、提高机体抵抗力、具有较高的抗肿瘤活性和一定的治疗效果[3-4]。

蛋白质的生理活性功能取决于蛋白质的结构。蛋白质分子来源不同，其生理活性功能也必定有所不同。此外，蛋白质产品的生理活性功能不仅取决于该产品的成分、结构形态，还取决于它与某些成分或所接触环境条件的影响[5-6]。但是，迄今为止关于大豆硒蛋白的研究主要集中在其生产制备、生理功能等相关应用方面，而关于大豆硒蛋白构象的研究则甚少。因此，对大豆硒蛋白构象的相关研究很有必要，这对于寻找和改善大豆硒蛋白功能特性的途径，进一步提高大豆硒蛋白的应用价值，具有重要的理论和实际意义。本工作结合荧光光谱、紫外光谱和红外光谱系统研究了大豆蛋白与大豆硒蛋白的结构区别，同时考察了浓度、温度、pH值等对大豆硒蛋白构象的影响，并对其乳化稳定性能进行了测定，从而为大豆硒蛋白产品的生产制备、生理活性功能评价等相关研究提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

AFS-920双道原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司)；RF-5301PC型荧光光谱仪(日本岛津公司)、TU-1901紫外-可见分光光度计(北京 普析通用)、CU-600电热恒温水浴箱(上海 一恒)、AEY-220型电子分析天平(湘仪天平仪器设备有限公司)、pHS-3C型数显pH计(雷磁上海精密科学仪器有限公司)、SC-3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

大豆硒蛋白粉(购于上海仙普生物科技有限公司)；磷酸氢二钠；柠檬酸；氯化钠；十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

样品硒含量测定：参照国标GB/T 5009.93-2003食品中硒的测定，采用氢化物原子荧光光谱法。经测定，本研究所用的大豆硒蛋白中的硒含量为31.9 μg·g-1。

溶液构象测定：称取0.10 g大豆硒蛋白粉于烧杯中，加适量蒸馏水，搅拌均匀，加20 mL pH 8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磁力搅拌器中速搅拌20 h，玻璃棒转至100 mL容量瓶，蒸馏水定容。低速离心机离心8 min后，取上清液，置于4 ℃下待用。然后，用移液管准确量取大豆硒蛋白上清液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至刻度，混匀后测定吸收光谱或荧光光谱。

乳化特性测定：取25 mL大豆硒蛋白溶液加入250 mL三角锥形瓶中，加入47.5 mL水，0.25 g氯化钠，混合均匀后，一边摇匀一边加入花生油10 mL，加完后，放置摇床振荡30 min使其分散成均匀的乳化液，静置待泡沫大部分消除后，观察乳化效果。然后从乳化层中取出2 mL于10 mL容量瓶中，加入0.1% SDBS溶液2 mL，混匀定容。以SDBS溶液作为空白，检测波长500 nm测其吸光值，并记录室温下不同时间样品的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

图1(a)表示激发光为290 nm时，0.1 g·L-1的大豆分离蛋白和大豆硒蛋白的荧光发射光谱。由图1可以看出，大豆蛋白在344 nm有一个明显的特征荧光峰，来源于大豆蛋白分子中具有长共轭π→π*跃迁的Trp残基。另外在323 nm有一个相对较弱的荧光峰。通过测试其他不同溶液体系的荧光实验，发现在其在323 nm左右都存在一个相对弱峰，这表明位于323 nm的荧光峰可归因为水分子的拉曼效应[7]。大豆硒蛋白在341 nm 有一个特征荧光峰，另外在323 nm 左右也存在有一个较弱的荧光峰。可见与大豆蛋白相比，大豆硒蛋白色氨酸的荧光发射峰发生一定程度的蓝移，荧光发射强度降低。这可能是因为硒元素代替硫元素以硒代半胱氨酸及硒代蛋氨酸的形式进入蛋白质分子内部，破坏了多肽链内半胱氨酸残基之间的共价二硫键(S—S)[8]。

图1 大豆蛋白与大豆硒蛋白荧光光谱图

2.2 荧光相图分析

为了明确大豆硒蛋白与大豆蛋白的结构区别，用荧光相图法对这两种蛋白在脲诱导下的去折叠过程进行了分析。选择荧光发射光谱斜率最大的两波长强度Fλ1和Fλ2作图。因荧光强度是广延量，两个变量满足下列关系式(1)

Fλ1=aFλ2+b

(1)

在蛋白质变构过程中，若式(1)为线性，则变构过程为“二态模型”；若式(1)表现为多条直线，则变构过程符合“多态模型”[9]。一般地，λ1和λ2只有分别取处于荧光发射峰两个斜面上所获得的荧光相图才更精确，并能提供更多的结构变化信息。因此，本文的λ1和λ2分别选取320和365 nm。

由图2(a)可知，在脲诱导大豆硒蛋白构象变化过程中，Fλ1和Fλ2变化呈一条显著直线，表明在所选浓度范围，脲诱导大豆硒蛋白构象变迁过程符合“二态模型”，即溶液中大豆硒蛋白只有“折叠”和“松散”两种状态。由图2(b)可知，脲诱导大豆蛋白去折叠的荧光相图由两条直线组成，这表明大豆蛋白的脲变性过程符合“三态模型”，即该蛋白从天然态转变为部分折叠中间态，并最终转变为去折叠态。这说明大豆硒蛋白与大豆蛋白在质构上有较大的区别。与大豆蛋白相比，大豆硒蛋白显然更容易被水解变性。

图2 脲诱导大豆硒蛋白(a)和大豆蛋白(b)去折叠过程的荧光相图

Fig.2 Fluorescence phase diagram for the unfolding of soybean selenoprotein (a) and soy protein(b) induced by urea

2.3 红外光谱

图3为大豆硒蛋白(a)与大豆蛋白(b)的红外光谱图。大豆蛋白的红外光谱1 800～1 000 cm-1是其指纹图谱，反映了一些特定基团的振动，其中在1 700～1 600 cm-1是计算其蛋白二级结构的主要谱带区域[10]。从图2中可以看出，在红外光谱1 700～1 600 cm-1区域内，两者的曲线几乎重合，但吸收强度略有差异，这表明大豆蛋白向大豆硒蛋白转变过程中，其蛋白二级结构发生了有少许变化。在红外光谱1 800～1 100 cm-1和2 850～3 037 cm-1区域内，大豆硒蛋白的红外光谱吸收率明显比大豆蛋白的弱，同时也有较大的位移，这表明大豆硒蛋白质中分子内和分子间的氢键减弱。此外，与大豆蛋白相比，大豆硒蛋白在1 742 cm-1处红外吸收峰消失，再次表明硒元素的引入破坏了多肽链内半胱氨酸残基之间的共价二硫键。

图3 大豆硒蛋白(a)与大豆蛋白(b)的红外光谱图

2.4 紫外光谱

图4为大豆蛋白和大豆硒蛋白在200～450 nm的紫外光谱。根据峰的位置，可以将其分成两个区域，即200～250 nm的肽键吸收峰区和250～300 nm的芳香氨基酸残基吸收峰区[11]。从紫外光谱可看出，大豆蛋白在240 nm有特征吸收峰，大豆硒蛋白在212 nm有特征吸收峰，这表明可归属为色氨酸的荧光发射峰。增加大豆硒蛋白浓度，光谱形状变化不大，但212 nm附近的吸收峰发生红移，吸收峰增强。吸收峰红移说明大豆硒蛋白分子微环境的极性发生改变；吸收强度增加说明大豆硒蛋白分子中的氢键作用减弱，螺旋成分降低，肽链发生伸展。此外，当大豆硒蛋白浓度增加时，在280 nm出现新吸收峰，推测其原因是大豆硒蛋白分子发生伸展后，该区域的Tyr残基更多地暴露于微环境中。

图4 大豆蛋白(a)与大豆硒蛋白(b: 0.1g·L-1;c: 0.2g·L-1)紫外光谱图

2.5 pH的影响

图5显示激发光波长为290 nm时，大豆硒蛋白在不同pH值条件下的荧光发射光谱强度及最大发射峰位变化图。由图5(b)可知，pH值的变化对大豆硒蛋白荧光光谱强度及其最大发射峰波长都具有明显的影响。其中，大豆硒蛋白的λmax分布在334～340 nm范围内见图5(a)。一般情况下，λmax与Trp残基所处的微环境有关，λmax小于330 nm说明Trp残基位于蛋白质分子内部的非极性环境中，λmax大于330 nm说明Trp残基位于蛋白质分子外部的极性环境中[12]。由此可推测，大豆硒蛋白在pH2.8～8范围内，其Trp残基主要分布于大豆硒蛋白分子外部的极性环境中。pH值从2.8升至4.6时，随着pH的增加，Trp的荧光强度逐渐增大，至pH值为4.6左右有最大荧光强度，说明此时Trp残基位于蛋白质的表面。此时λmax发生蓝移，表明在此环境下Trp残基位于蛋白质中较为疏水的区域。pH值在4.6～7.2范围时，随着pH的增加，Trp的荧光强度逐渐减小，而λmax向长波方向移动，表明原来处于结构内部非极性环境中的Trp残基转移到蛋白质分子外部，其所处微环境极性增加。当pH值继续升至8.0时，OH-离子进攻Trp残基中亚氨基的氢，破坏了吲哚环的共轭性，增加了π→π*跃迁的能量，使大豆硒蛋白λmax再次发生蓝移。从光谱变化趋势看，在酸性环境中时，大豆硒蛋白的二级结构不稳定，较易发生从松散到折叠的构象转变。相对而言，碱性条件则较有利于大豆硒蛋白以松散的结构存在。

图5 pH值对大豆硒蛋白荧光光谱的影响

2.6 温度的影响

配制一定浓度大豆硒蛋白溶液，水浴加热，温度从20 ℃逐渐升至50 ℃。每隔5 ℃测定体系荧光谱。图6为温度对大豆硒蛋白溶液荧光光谱强度的影响。由图6可以看出，随着温度升高，大豆硒蛋白最大荧光发射峰波长发生一定的蓝移，同时体系荧光强度逐渐降低，且明显不呈线性关系。这表明随者温度升高，大豆硒蛋白溶液不仅存在明显荧光热猝灭效应，而且体系的疏水性也逐渐增强，大豆硒蛋白分子趋于折叠。由此推测，温度升高，热运动使得大豆硒蛋白疏水核能更多地进入水相，从而使其Trp残基分子链的构象在一定程度上发生了转变。

此外，通过使用Origin7.5软件, 对图6(a)中数据作了拟合。如图6(b)所示, 得到了大豆硒蛋白最大峰值强度随温度变化的拟合曲线。拟合公式为y=589.26-34.58x+1.09x2-0.01x3，其相关系数r=0.975。

图6 温度对大豆硒蛋白荧光光谱(a)及荧光强度(b)的影响

Fig.6 The influence of temperature on the fluorescence spectra (a) and intensity (b) of soybean selenoprotein Curve 1→7, 20, 25,30, 35, 40, 45, 50 (℃)

2.7 乳化特性测定

图7为20和30 ℃大豆硒蛋白乳化溶液随时间的变化关系图。从图7可以看出，随着放置时间的延长，大豆硒蛋白乳化溶液的吸光度逐步增强，并且出现明显转折点。这表明大豆硒蛋白虽然有一定的乳化性, 但随着时间的延长，体系中水和油开始慢慢分离出来而失去稳定性，其后大豆硒蛋白溶液分子链发生线团-双螺旋链构象转变而聚集成为凝胶。从图7中还可看出，温度较低时，大豆硒蛋白乳化溶液吸光度较低，且出现破乳的时间较早。这表明低温时大豆硒蛋白乳化性增强，但其稳定性下降。

图7 不同温度下大豆硒蛋白吸光度随时间的变化(T1>T2)

3 结 论

大豆硒蛋白与大豆蛋白相比，其分子构象有一定的差异。大豆硒蛋白分子中的氢键作用减弱，螺旋成分降低，蛋白质分子发生伸展。在水溶液中, 环境的酸碱度对大豆硒蛋白的结构有着较大的影响。强酸条件下，H+对大豆硒蛋白的氢键和肽键均有一定的干扰作用，且会影响大豆硒蛋白Trp残基酚羟基的电离。相对而言, 碱性条件则更有利大豆硒蛋白结构的稳定存在。升高温度，大豆硒蛋白分子内的氢键作用破坏，大豆硒蛋白分子趋于折叠，溶液疏水性增强。通过荧光数据拟合，得到了荧光强度随温度的变化关系。此外，一定条件下大豆硒蛋白乳化性与其稳定性呈现负相关。

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(Received May 13, 2015; accepted Sep.18, 2015)

*Corresponding author

Study on the Conformation of Soybean Selenoprotein Solution with Spectroscopy Methods

HU Yong, WU Xiao-yong*, ZHONG Nan-jing, XU Jin-rui

School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China

The structure characteristic of soybean selenoprotein and soy protein isolate (SPI) were investigated with fluorescence, ultraviolet and Fourier transform infrared (FTIR) spectrum.The unfolding process of two proteins was analyzed with fluorescence phase diagram method.The stability of emulsion properties and the influence of concentration, temperature and pH on the conformation of soy selenoproteins were also determined.The results indicated that the covalent disulfide bond of soybean selenoprotein molecules was damaged; the hydrogen bonding become weak; the hydrophobic interactions were enhanced and the protein chain molecules were extended.Soybean selenoprotein displayed only “folding” and “loose” state in solution, which illustrated soybean selenoprotein more tend to hydrolysis when compared with soybean protein.With temperature increasing, the fluorescence quenching effect occurred and the hydrophobicity of soy selenoproteins was also gradually increased, which reflected the protein molecules tends to be folded.In the range of pH 2.8～8.0, the Trp residue of soybean selenoprotein was mainly distributed in the polarity of the external environment and presented different conformational change on both sides of the isoelectric point under different pH value.In acidic environment, the soybean selenoprotein was easy to appear conformational transition from loose to fold.But it was conducive for soybean selenoprotein to existence in loose structure in alkaline conditions.In addition, the emulsifying properties of soybean selenoprotein were analyzed based on UV spectral data.Results showed that lower temperature helps to enhancement the emulsification but unfavorable the stability of the soybean selenoprotein.

Soybean selenoprotein; Conformation; Spectroscopy

2015-05-13，

2015-09-18

国家自然科学基金项目(31401521)资助

胡 勇, 1977年生，广东药科大学食品科学学院讲师 e-mail: lidhyong@126.com *通讯联系人 e-mail: perryfe@163.com

S132

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2874-05