CAMP/PKA通路在结直肠癌肝转移中的作用及机制研究

钱晶蒋学通徐传奇王道荣



•论著•

CAMP/PKA通路在结直肠癌肝转移中的作用及机制研究

钱晶1蒋学通2徐传奇2王道荣2

【摘要】目的 构建小鼠结直肠癌肝转移模型，探讨CAMP/PKA通路在结直肠癌肝转移中的作用机制。方法 采用皮下成瘤盲肠部位包埋的方法，建立结直肠癌肝转移小鼠模型，随机分为实验组及对照组。实验组模型小鼠连续7天注射CAMP类似物，并于注射完成后7天、14天、28天处死小鼠，采用免疫组化的方法检测两组小鼠原发灶及转移灶内CAMP、PKA、VEGF的表达，采用实时定量PCR的方法检测正常组织及癌组织内MMP2、E-钙粘蛋白的表达。结果 成功建立结直肠癌肝转移小鼠模型，实验组较同期对照组原发灶变小，腹腔及肝脏转移瘤少。两组中转移灶VEGF的表达高于原发灶，癌组织中E-钙粘蛋白表达低于正常组织，MMP2高于正常组织。实验组中随着药物作用时间延长，CAMP、PKA、VEGF、MMP2的表达逐渐变弱。E-钙粘蛋白的表达逐渐升高。结论 CAMP/PKA可通过调节VEGF、E-钙粘蛋白、MMP2的表达，促进结直肠癌发生肝脏转移。

【关键词】结直肠肿瘤； 新生血管化，病理性； CAMP/PKA； 上皮间质转化

结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年升高。肝脏转移是影响结直肠癌患者预后的主要因素，大约有20％～25％的结直肠癌患者确诊时已发生肝脏转移，即使行原发灶肿瘤切除术后，仍有30％可发生异时性肝脏转移。目前结直肠肝脏转移的机制仍不明确，多项研究证实血管生成及上皮间质转化在结直肠癌肝转移中的作用至关重要［1-2］。

CAMP/PKA通路是一条经典的G蛋白偶联的细胞信号传导途径，参与多项细胞生理活动。而有研究证实CAMP/PKA参与VEGF的分泌及表达［3］，但其在结直肠癌肝转移中的作用未被研究，我们通过构建结直肠癌肝转移的小鼠模型，研究CAMP/PKA通路在结直肠癌肝转移中的作用，并对其机制初步探讨。

资料与方法

一、一般资料

SPF级4～6周龄的Bal b/c雄性小鼠，体重20～26克，够买并饲养于扬州大学比较医学中心；CT26细胞购于中国科学院，CAMP、PKA、VEGF蛋白单克隆抗体购于美国Santa Cruze生物公司，工作浓度为1：50；SP试剂盒购于福州迈新生物技术公司。PCR试剂盒购于Takala公司。

二、模型建立

CT26细胞培养于1640培养基，通过细胞传代，胰酶消化、吹打，制备CT26细胞株细胞悬液，于大鼠腋下注射，细胞注射量为1×107/200 μl，10 d左右长出直径1 cm的肿块，少量组织性HE染色。按照300 g/1.0 ml水合氯醛的给药剂量，给大鼠麻醉，纵向切开左下腹皮肤约2 cm，将大鼠的盲肠拖出至皮下，将肿瘤块缝合于肠组织上，缝合皮肤。

三、实验分组与干预

将模型小鼠分为实验组和对照组两组，实验组予以8-溴-cAMP 60 mg/kg/d的剂量腹腔注射连续7 d，分别于第7 d，14 d，28 d处死小鼠，检测相关指标。对照组无特殊处理，同期处死对照组小鼠，检测相关指标。

四、观察的指标与检测方法

1.皮下移植瘤形成情况，通过HE染色证实为肿瘤形成；2.盲肠原位包埋肿瘤后，腹腔内转移瘤形成情况，包括肝脏转移，腹腔转移及大小；3.免疫组织化学检测组织内CAMP、PKA、VEGF表达，PCR方法检测实验组和对照组原发灶及转移灶中MMP2及E-钙粘蛋白的表达。

五、统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为显著性检验。

结 果

一、模型建立情况

小鼠于皮下注射肿瘤细胞，最早5天形成转移瘤，10天左右生长出皮下瘤可形成约1 cm肿块。盲肠部位的包埋皮下瘤的方法，成功建立结直肠癌肝转移模型。见图1。

二、原发灶与转移灶生长情况

随着时间推移，实验组及对照组均表现为原发灶的生长，腹腔内及肝脏转移瘤的形成，但实验组原发灶生长更加缓慢，相同腹腔内及肝脏内转移肿瘤数目少、体积小。具体见表1。

图1 结直肠癌肝转移模型

三、CAMP、PKA、VEGF表达情况

实验组及对照组中肝转移灶中VEGF表达较原发灶升高。实验组中CAMP的表达随着用药时间的延长，表达量逐渐减少、且PKA、VEGF表达也呈现逐渐下降趋势。见图2。

四、MMP2及E-钙粘蛋白的表达

（一）MMP2的表达

实验组及对照组中MMP2表达均较正常组织升高，但实验组中原发灶MMP2表达较对照组下降，且随着药物作用时间的延长，实验组原发灶MMP2的表达逐渐下降。见图3。

表1 不同时期原发灶大小及转移瘤数目表

注：**表示两者之间有统计学意义（P＜0.05）图3 实验组及不同时间段对照组中MMP2表达

（二）E-钙粘蛋白的表达

实验组及对照组的原发灶中E-钙粘蛋白的表达较正常组织下降，但实验组原发灶中较对照组中表达上升，且随着药物作用时间延长，E-钙粘蛋白的表达呈现逐渐升高的趋势。见图4。

讨 论

CAMP/PKA通路是一条经典的由G蛋白偶联受体介导的细胞信号传导通路，外界信号分子刺激膜体后，激活细胞内的腺苷酸环化酶，导致细胞内CAMP水平升高，从而激活PKA，产生一系列的生物学反应。目前已证实，其参与细胞的增殖、分化及凋亡、离子转运、调节新陈代谢、基因转录相关［4］。PKA作为CAMP的下游分子，由催化亚基及调节亚基构成，催化亚基可介导多种底物蛋白的磷酸化，而调节亚基的两种亚型RⅠ与RⅡ则主要参与细胞的增殖与分化。一旦外界因素导致细胞内RⅠ型亚基优势表达，导致细胞的无限的增殖，肿瘤形成。

注：**表示两者之间有统计学意义（P＜0.05）图4 实验组及不同时间段对照组的原发灶中E-钙粘蛋白的表达

血管生成及上皮间质转化的形成是肿瘤发生侵袭转移的两种重要的途径。VEGF是诱导血管形成的重要的因子，在肿瘤的血管生成及侵袭转移中有重要的作用，有研究证实VEGF的表达与CAMP的激活相关。在皮下海绵移植的小鼠模型中，激活cAMP的合成能促进血管内皮细胞分泌VEGF，从而促进肿瘤血管的形成［5］。Namkoong等［3］发现腺苷酸环化酶激动剂能促进人血管内皮细胞分泌VEGF从而促进血管形成。E-钙粘蛋白及MMP2是介导上皮间质转化的重要的因子，有研究表明，在子宫肌瘤中CAMP/PKA通路的激活能够调节肿瘤细胞MMP2的表达［6］。E-钙粘蛋白是上皮细胞的连接分子，在上皮细胞发生肿瘤及间质转化的过程中，其表达常常会下降［7］。CAMP/PKA通路在上皮间质转化的作用及对E-钙粘蛋白表达的影响仍未被研究证实。

本研究通过使用CAMP的类似物（8-溴-CAMP）干预结直肠癌肝转移小鼠模型，分别在在药物处理后7天、14天、28天处死小鼠。从实验结果分析，8-溴-CAMP能够抑制小鼠产生肝脏转移及腹腔转移，同时试验组发生肝脏转移的数目及大小都较对照组减少，说明CAMP/PKA通路在结直肠癌侵袭转移尤其是肝转移起作用。检测原发灶及转移灶中的CAMP、PKA、VEGF的表达，发现原发灶及肝转移灶中VEGF的表达差异，说明VEGF在结直肠肝转移中起到重要的作用。随着用药时间的延长，VEGF的表达逐渐下降，与CAMP及PKA的表达呈一致性，推测CAMP/PKA通路能够通过调节VEGF的表达促进结直肠癌的肝脏转移。

图2 CAMP、PKA、VEGF的表达

利用PCR技术检测实验组及对照组中肿瘤组织与正常组织中E-钙粘蛋白及MMP2，其中E-钙粘蛋白在癌组织中的表达是低于正常组织，且随着药物作用时间的延长，E-钙粘蛋白的表达逐渐增高，推测在肿瘤组织内的CAMP/PKA的激活可抑制E-钙粘蛋白的表达，导致肿瘤侵袭能力增加，发生远处转移。MMP2也是上皮间质转化中的经典分子，本研究实验结果显示癌组织内表达要高于正常组织，且随着用药时间的延长，MMP2在癌组织内的表达呈下降趋势，且随着MMP2表达的下降，肝脏转移数目逐渐减少。推测CAMP/PKA激活可促进癌组织内MMP2的表达，促进结直肠癌发生肝转移。

本研究结果显示：CAMP/PKA通路促进VEGF的表达参与肿瘤新生血管生成促进结直肠癌发生肝转移，同时促进MMP2的表达和抑制E-钙粘蛋白的表达，促进上皮间质转化的形成，导致结直肠癌发生肝转移。

参 考 文 献

［ 1 ］ Roger L， Jullien L， Gire V， et al. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells ［J］. J Cell Sci， 2010， 123（Pt 8）： 1295-1305.

［ 2 ］ van der Wal GE， Gouw AS， Kamps JA， et al. Angiogenesis in synchronous and metachronous colorectal liver metastases： the liver as a permissive soil ［J］. Ann Surg， 2012， 255（1）： 86-94.

［ 3 ］ Namkoong S， Kim CK， Cho YL， et al. Forskolin increases angiogenesis through the coordinated cross-talk of PKA-dependent VEGF expression and Epac-mediated PI3K/Akt/eNOS signaling ［J］. Cell Signal， 2009， 21（6）： 906-915.

［ 4 ］ 任伟宏.蛋白激酶与细胞凋亡信号及凋亡抑制信号的转导［J］.国外医学： 临床生物化学与检验学分册， 2004， 25（1）： 79-82.

［ 5 ］ Amano H， Ando K， Minamida S， et al. Adenylate cyclase/protein kinase A signaling pathway enhances angiogenesis through induction of vascular endothelial growth factor in vivo ［J］. Jpn J Pharmacol，2001， 87（3）： 181-188.

［ 6 ］ 刘珏， 申清香， 李兴， 等.来曲唑通过cAMP-PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2的表达［J］.中国现代医生，2013， 51（16）： 4-7.

［ 7 ］ Christofori G， Semb H. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene ［J］. Trends Biochem Sci，1999， 24（2）： 73-76.

（本文编辑：杨明）

钱晶， 蒋学通， 徐传奇， 等. CAMP/PKA通路在结直肠癌肝转移中的作用及机制研究［J/CD］. 中华结直肠疾病电子杂志，2016， 5（3）： 244-248.

The effect and mechanism of CAMP/PKA pathway in colorectal liver metastases

Qian Jing1， JiangXuetong2， Xu Chuanqi2， Wang Daorong2.1Department of General Surgery， Medicine School of Yangzhou University， Yizheng Hospital of Nanjing Gulou Hospital Group， Yangzhou 225001， China；2Gastrointestinal Centre， Clinical Medical College of Yangzhou University， Subei Peopleʹs Hospital，Yang zhou 225001， China Corresponding author: Wang Daorong， Email: daorong666@sina.com

【Abstract】Objective To establish a mouse model of colorectal liver metastasis，and to explore the mechanism of CAMP/PKA pathway in colorectal liver metastasis. Methods To establish a mouse model of colorectal liver metastasis by embedding subcutaneous tumor in the appendix， and randomly divided into experimental group and control group. The mice of experimental group were injected CAMP analogs for 7 days， the mice were sacrificed in 7 days， 14 days， and 28 days after injection. The expression of CAMP，PKA and VEGF in two groups were detected by immunohistochemical method. The expression of MMP2 and E-cadherin in normal tissue and cancer tissue were detected by quantitative PCR. Results It was succeed to establish a mouse model of colorectal liver metastasis. Comparing to control group， the number of liver metastasis and volume of primary tumor were small in experimental group. The expression of VEGF in the two groups was higher than that in the primary tumor. The expression of E-cadherin in the cancer tissues was lower than that in the normal tissues， and MMP2 was higher than that in the normal tissues. In the experimental group， the expression of CAMP、PKA、VEGF、MMP2 were gradually decreased， while the expression of E-cadherin was increased gradually. Conclusion CAMP/PKA promoted colorectal liver metastasis by regulating the expression of VEGF， E-cadherin and MMP2.

【Key words】Colorectal neoplasms； Neovascularization， pathologic； CAMP/PKA； Epithelial mesenchymal transition

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.03.010

作者单位：225001 扬州大学医学院，南京鼓楼医院集团仪征医院普外科1；225001 扬州大学临床医学院苏北人民医院胃肠中心2

通讯作者：王道荣，Email：daorong666@sina.com

收稿日期：（2016-04-02）