柴芍平痫汤对癫痫幼龄大鼠脑内γ-氨基丁酸含量的影响

魏冲，　张葆青



实验论著

柴芍平痫汤对癫痫幼龄大鼠脑内γ-氨基丁酸含量的影响

魏冲，张葆青

250014 济南，山东中医药大学(魏冲)；250011济南，山东中医药大学附属医院儿科(张葆青)

【摘要】目的研究柴芍平痫汤对癫痫幼龄大鼠脑内γ-氨基丁酸含量的影响，探索其作用机制。方法70只SD大鼠随机分为7组，分别为中药低、中、高剂量组、西药组、中西药治疗组、模型组、正常对照组，每组10只。对SD大鼠腹腔注射戊四氮建立癫痫模型，观察行为学，以柴芍平痫汤对其进行干预治疗24 d后ELISA法检测脑组织γ-氨基丁酸(GABA)的含量。结果中西药治疗组用药后24 d惊厥等级与用药前1 d惊厥等级比较差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组无差异；中药低、中、高剂量组，西药组，中西药治疗组均比模型组脑组织内γ-氨基丁酸含量高，差异有统计学意义(P<0.01)；各治疗组及模型组γ-氨基丁酸含量与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论通过实验得出柴芍平痫汤对癫痫大鼠惊厥等级、脑组织内γ-氨基丁酸含量的降低均有治疗作用。

【关键词】癫痫；戊四氮；γ-氨基丁酸；卡马西平;儿童

癫痫是多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所致的临床综合征。本病发作对人体的危害是多方面的，其中最重要的是大脑损伤，具有长期性、反复发作性、难治性特点[1]。建立动物模型模拟癫痫的发作并通过药物治疗以观察其疗效机制已成为筛选抗癫药物，寻找抗癫新法的重要手段。本实验选用腹腔注射戊四氮的方法制备癫痫大鼠点燃模型，造模过程中发现，随着时间的增加，大鼠惊厥的等级逐渐增加，呈现不同的发作形式，从面部抽搐、凝视逐渐发展到全身肌阵挛，僵直-阵挛惊厥等，由于戊四氮无神经毒性作用，且其血药浓度在造模过程中不会随着注射时间的增加而变多，并选用28 d幼龄大鼠，相当于个体成长过程中的儿童期，因此本课题所制备点燃模型可近似模拟包括原发性癫痫在内的多种儿科癫痫发作形式。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级新生28 d健康SD大鼠70只，雄性，体质量(81.5±8.2)g，大鼠及垫料、鼠粮均由山东鲁抗医药股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2013-0001。SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为7组，分别为中药低、中、高剂量组、西药组、中西药治疗组、模型组、正常对照组，每组10只。

1.2药品、试剂及器械柴芍平痫汤(柴胡、桂枝、半夏、川芎、黄芩、生甘草各6 g，白芍12 g，葛根15 g，采用免煎颗粒自行配制，浓度20 g/L，药品均购于江阴天江药业有限公司；卡马西平(齐鲁制药有限公司，批号：4060042LA)；戊四氮(购于美国Sigma公司)；生理盐水(山东圣鲁制药有限公司，批号：1405263)；大鼠γ-氨基丁酸ELISA检测试剂盒(研域生物科技有限公司，批号：KB2981)；DAB显色试剂盒(北京中杉)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；台式低速离心机(eppendorf公司)；-20 ℃低温冰箱(青岛海尔)；隔水式恒温培养箱(上海精宏科技有限公司)。

1.3制备模型戊四氮配制：每日注射前半小时配制，以蒸馏水配成20 mg/kg溶液。正常对照组腹腔注射生理盐水32 mg/kg，其余各组腹腔注射戊四氮32 mg/kg，每日1次，连续注射28 d，注射时间8:30～10:00，并于注射后观察大鼠行为学1 h。每隔1 d测量大鼠体质量，并相应调整戊四氮注射剂量。28 d后停止处理1周，然后以相同剂量的戊四氮处理1周。

1.4惊厥程度七点评分法0级：无惊厥；1级：点头或头部抽搐；2级：全身肌阵挛；3级：头部抽搐加前肢阵挛；4级：阵挛惊厥加后腿站立；5级：跌倒；6级：全身强直-阵挛性惊厥[2]。

1.5点燃标准凡获连续5次2级或2级以上惊厥记录的大鼠，被认为已完全点燃。完全点燃后停止腹腔注射戊四氮，用于后续实验。

1.6给药方法剂量按大鼠与成人的体表面积比进行折算：成人用药量×6.3=大鼠用药量。根据此公式计算出大鼠用药量，并对点燃的大鼠进行灌胃治疗。中药高、中、低剂量组分别给予柴芍平痫汤12、8、4 g/kg，中西药结合组给予柴芍平痫汤8 g/kg+卡马西平120 mg/kg，西药组给予卡马西平120 mg/kg，模型组及正常对照组予生理盐水每次2 mL，各组均灌胃24 d，每日2次。

除正常对照组外各组分别于灌胃前1 d，灌胃后24 d给药1 h后给予腹腔注射戊四氮32 mg/kg，记录戊四氮癫痫点燃大鼠惊厥发作的情况，包括根据评分法记录其发作等级；正常对照组腹腔注射生理盐水32 mg/kg，并记录日常行为。

1.7脑组织内γ-氨基丁酸含量检测将大鼠脱颈椎处死，从枕骨大孔处将皮肤剪开，暴露至鼻间缝，用直剪一侧的尖端于鼻间缝上方做一圆孔，把直剪合拢，尖端放入孔中，钝性分离撑开颅骨，完全暴露脑组织后，用剪刀于脑组织根部剪断，用镊子取出脑组织，迅速放入预冷的生理盐水中，冰浴中制成20%的组织匀浆，3 000 r/min，离心10 min(离心半径为3 cm)，取上清，-80 ℃冰箱冻存备用。

1.8脑组织内γ-氨基丁酸含量的检测方法(1)标准品的稀释：按照0、1.25、2.5、5、10、20、40 μL的顺序加入96孔板中，然后用磷酸盐缓冲液将其补齐至50 μL。(2)加样：设置空白孔、标准孔、待测样品孔3个孔，空白对照孔不加酶标试剂及样品，其余各步操作无异。在酶标包被板上标准品准确加样至50 μL，待测样品孔中加入40 μL样品稀释液，再加10 μL待测样品，将其稀释5倍。将样品加于酶标板孔底部，加样时尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。(3)温育：用封板膜将其封板，并置37 ℃环境下温育处理30 min。(4)配液：用蒸馏水30倍将浓缩洗涤液稀释，以备后续实验。(5)洗涤：去掉封板膜，过程中仔细小心，并弃去液体，甩干，并在每孔中加入洗涤液，使之加满，无处理30 s后弃去，将此过程重复5次，5次结束后将其拍干。(6)加酶：除空白孔外，其余各孔均加入酶标试剂50 μL。(7)温育：操作方法同第3步。(8)洗涤：操作方法同第5步。(9)显色：先加入显色剂A 50 μL至每个孔中，之后加入显色剂B 50 μL，将其轻震混匀，显色15 min，显色环境为37 ℃并避光。(10)终止：在每孔加终止液50 μL，以终止反应。(11)测定：加终止液后15 min以内，以空白孔调零，使用450 nm波长依次测定各孔的吸光度(OD值)。(12)计算：以OD值为纵坐标，标准物的浓度为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，测出样品的实际浓度。

2结果

2.1造模结果腹腔注射戊四氮第1天，部分大鼠出现凝视，面部肌肉抽动及点头运动；注射3 d后，有18只大鼠出现3级及3级以上发作，2只大鼠出现6级发作；注射1周后5只大鼠造模成功；注射4周后52只大鼠造模成功；造模过程中7只大鼠死于惊厥严重发作，2只大鼠死于感染，2只大鼠死于大鼠间争斗；7只大鼠始终造模未成功；造模总成功率74.29%(52/70)。

2.2用药前及用药不同时间后大鼠惊厥等级比较见表1。

表1　用药前后不同时间惊厥等级比较±s，级)

注：与用药前1 d比较，at=2.39，P<0.05。

表1结果表明，各治疗组大鼠惊厥发作等级随药物的使用均有不同程度的下降，中西药治疗组用药后24 d惊厥等级与用药前1 d惊厥等级比较差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组用药后24 d与用药前1 d比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示中西药治疗组较其他治疗组对惊厥发作等级的治疗作用明显。2.3各组大鼠脑组织γ-氨基丁酸含量测定结果见表2。

表2　各组大鼠脑组织中γ-氨基丁酸含量

注：与模型组比较，aP<0.01；与正常对照组比较，bP<0.01。

表2结果表明，中药低、中、高剂量组，西药组，中西药治疗组均比模型组脑组织内γ-氨基丁酸含量高，差异有统计学意义(P<0.01)；各治疗组及模型组γ-氨基丁酸含量与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3讨论

实验性动物癫痫模型的建立已成为癫痫研究中重要的组成部分，通过动物实验可探讨癫痫的发病机制，研发和筛选新型的抗癫药物等。本课题选用腹腔注射戊四氮的方法制备癫痫大鼠点燃模型，癫痫模型脑内并无癫痫病灶[2]。模型制备成功后，于用药前1 d腹腔注射相同浓度的戊四氮，观察大鼠惊厥等级及发作持续时间以作为对照，于用药后24 d予相同处理，并记录与用药前1 d进行统计学分析发现，中西药治疗组用药24 d后惊厥等级与用药前比较有显著差异，优于中药高、中、低剂量组及西药组，而正常对照组惊厥等级有一定程度的增加，说明模型制备成功后随着时间的增加，惊厥等级呈现上升的趋势，结合其他各组惊厥等级的降低，从另一方面说明各治疗组对惊厥发作等级确有疗效。两药合用具有协同作用，对癫痫发作等级的抑制作用更强。

中枢神经系统内抑制性氨基酸的功能降低,兴奋性氨基酸的功能增高在癫痫的发生、发展过程中起着重要的作用。γ-氨基丁酸为脑中重要的抑制性氨基酸类神经递质，其含量很高，仅次于谷氨酸[3]。有研究证实，神经系统中约有20%～40%的突触为γ-氨基丁酸突触，而γ-氨基丁酸含量的异常改变常导致癫痫的发生。脑内γ-氨基丁酸浓度低于40%时则引发癫痫[4]。

脑内谷氨酸经谷氨酸脱羧酶处理后生产γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸在γ-氨基丁酸转氨酶的作用下去除其氨基，缺少氨基的γ-氨基丁酸生成琥珀酸半醛，再经其脱氢酶的氧化作用，将其生成琥珀酸，经过三羟酸循环，或由琥珀酸半醛还原酶将其还原成γ-氨基丁酸，被去除的氨基则经α-酮戊二酸处理重新生产谷氨酸，而琥珀酸半醛脱氢酶活性极强，在上述的反应中氧化反应为主,因此生成γ-氨基丁酸反应较重新生成谷氨酸反应占优势。

脑内的谷氨酸作为γ-氨基丁酸合成的前身物质，仅有小部分为中间产物，正常状态下γ-氨基丁酸随着谷氨酸的升高而升高，而γ-氨基丁酸的升高反过来抑制谷氨酸的升高，从而使二者达到一个相对的平衡。癫痫的发作是一个复杂的过程，其中某些因素导致脑内γ-氨基丁酸含量降低，破坏与谷氨酸之间的平衡，致其抑制性功能下降，则导致癫痫的发生。张云强等[5]、龚誉华等[6]都通过实验验证了癫痫模型γ-氨基丁酸含量明显降低，这与本实验结果一致。

造模成功后，通过柴芍平痫汤及卡马西平对癫痫大鼠进行灌胃治疗后，各治疗组γ-氨基丁酸含量与模型组相比明显上升，其中中西药治疗组作用最为优异，高于西药组及中药高、中、低剂量组，并且都与模型组有显著差异，说明柴芍平痫汤对γ-氨基丁酸确有明显的升高作用。推测柴芍平痫汤对癫痫的治疗作用很可能与升高脑组织内的γ-氨基丁酸含量有关系。

柴芍平痫汤是由古方柴胡桂枝汤化裁而来，近现代研究证实其具有良好的抗癫作用[7-8]。本方由柴胡、白芍、桂枝、半夏、川芎、葛根、黄芩、生甘草组方而成，其中柴胡苦、辛、微寒，归肝胆经，具有疏肝解郁，升举阳气，解热等作用，始载于《神农本草经》，柴胡于明代开始多被用作癫痫的治疗，现代药理研究指出柴胡具有镇静、安定等广泛的中枢抑制作用。黄芩味苦、寒。可清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎，现代药理研究认为黄芩具有解热、镇静、抗氧化、调节cAMP水平作用，有研究指出黄芩具有抗癫作用[9]，其作用机制为减少神经细胞再癫痫发作后的坏死、凋亡，对神经元进行保护。《医学启源》记载半夏“治寒痰及形寒饮冷……治太阴痰厥头痛，非此不能除。”作为燥湿化痰之要药，还具有降逆止呕，消痞散结之功效。柴胡、黄芩配伍寓双解之义，其一表一里、一升一降,早在《本草纲目》即有记载：“柴胡行手足少阳,以黄芩为佐”，两者升降相配；合黄芩、半夏辛开苦降，共调逆乱之气机。

方中白芍具有滋阴养血除烦，平抑肝阳的功效，归肝、脾经，其所含成分芍药苷具有较好的解痉作用。桂枝味辛、甘、温。归心、肺、膀胱经。具有发汗解肌，温经通脉，助阳化气作用，其主要成分桂皮醛可镇静、抗惊厥；桂枝可直接阻滞Ca2+通道或γ-氨基丁酸受体，抑制癫痫大鼠脑内突触传递过程，具有抗癫作用[10]。川芎可上行头目，入肝、胆、心包经，有活血行气，曲风止痛之功，并可对动物中枢神经系统起镇静作用[11]。柴、桂相配可舒肝利气，柴、芍二药，散收相合，相互制约，使疏散得度，敛而不滞；三药相合可土中泻木，收散有度，不至“伐生发之气也”。葛根可解肌退热，生津止渴，升阳止泻作用，并具有增加脑血流量的作用，能增加氧供应，并具有β受体阻滞作用，有明显解痉作用。甘草有解毒、祛痰、止痛、解痉等作用，其性平,味甘,能补脾益气,缓急解毒,调和百药等。此方中除调和诸药外，还可与芍药配伍，取其酸甘化阴之效。桂枝、芍药、甘草合用更是取桂枝汤调和营卫之意。诸药合用可调气机、平阴阳、和营卫，具有镇静安神，疏肝解郁,和解止痉之用。

癫痫病因复杂，临床表现多种多样，不易根除[12]，临床中治疗癫痫多是以一种或者多种西药联合治疗为主，而中医治疗癫痫的作用往往被忽略，通过本实验研究得出，中药对癫痫确有治疗作用，中药与西药联用作用优于西药组及中药组单用，加之中药毒副反应小，无戒断反应等问题，在将来癫痫的治疗中，中药将发挥更为巨大的作用，占有重要地位。

参考文献

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(本文编辑：刘颖)

Effect of Chaishao Pingxian(epilepsy-relieving) decoction on brain GABA content of young rats with epilepsy

WEIChong,ZHANGBaoqing.

ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250014，China.

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of Chaishao Pingxian decoction on brain GABA content of young rats with epilepsy and to investigate its mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into 7 groups,by number,namely,low-(A),moderate(B) and high-dose(C) group,western medicine group(D),Chinese and western medicine group(E),model group(F) and normal control group(G),with 10 rats in each group.PTZ was injected into SD rats to establish epilepsy model and the behavior was observed.Chaishao Pingxian decoction was given as intervention treatment and after 24 days ELISA was used to determine GABA content in brain tissues.ResultsThere was statistical difference on convulsion grade between 24d after treatment and 1d before treatment in group E,but no difference in the other groups.Compared with group F,GABA content was higher in group A,B,C,D and E,and difference was statistical(P<0.01).When comparing GABA content of group G with that of the other six groups,there was statistical difference(P<0.01).ConclusionChaishao Pingxian decoction has therapeutic effect on the epilepsy grade and the decrease of GABA content in brain tissues in tats with epilepsy.

【Keywords】Epilepsy;PTZ;GABA;CBZ；Rat

作者简介：魏冲(1989-)，男，山东中医药大学2008级七年制本硕连读生。研究方向：小儿呼吸系统、神经系统疾病的研究 通讯作者：张葆青，E-mail：459356800@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.03.004

【中图分类号】R363

【文献标识码】A

【文章编号】1674-3865(2016)03-0261-04

(收稿日期：2015-12-08)