缺氧缺血致脑白质损伤的新生大鼠脑中ephrinB2和EphB4表达的研究

房贵巍，　张丽华，　许洪伟，　孙颖



实验论著

缺氧缺血致脑白质损伤的新生大鼠脑中ephrinB2和EphB4表达的研究

房贵巍，张丽华，许洪伟，孙颖

154000 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学康复医学院研究生处(房贵巍)；154002 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学附属第三医院脑瘫康复二科(张丽华，许洪伟，孙颖)；佳木斯大学儿童神经康复实验室(张丽华，许洪伟，孙颖)

【摘要】目的评估缺氧缺血诱导的脑白质损伤大鼠模型脑组织中的微血管密度和ephrinB2及其受体EphB4表达的水平。方法将新生3日龄Wistar大鼠60只随机分为实验组和假手术组各30只。实验组行右侧颈总动脉永久性结扎后给予氮氧混合气体(94% N2+6% O2)4 h；假手术组只分离右侧颈总动脉但不结扎并常规给氧。4 d后分别测定第7日龄大鼠脑组织中微血管密度以及ephrinB2和EphB4表达的水平。结果实验组大鼠脑组织中的微血管密度、ephrinB2和EphB4的水平高于假手术组；假手术组大鼠脑组织中表达的ephrinB2和EphB4的百分比相近，实验组大鼠脑组织中ephrinB2的表达高于EphB4。结论缺氧缺血诱导的脑白质损伤后有新生血管生成，并且动脉多于静脉。

【关键词】脑白质损伤；缺氧缺血；微血管密度；ephrinB2；EphB4；大鼠

近年来，随着新生儿救治水平的提高，早产儿的存活率也随之提高，然而幸存下来的早产儿，尤其是那些极低出生体重儿却容易产生脑损伤，导致认知、行为障碍、脑性瘫痪等后遗症，这已经成为了严重的公共健康问题[1]。脑白质损伤又称脑室周围白质软化，是早产儿脑损伤的主要神经病变[2-3]。脑白质损伤可分为两种形式：局灶性损伤和弥漫性损伤，这种局灶性和弥漫性损伤在一定程度上似乎与供应脑白质血管的发展有关。在早产儿脑中这些血管的末端没有得到充分发育，因此，脑血流量减少，这些区域遭受严重缺血[4]。Marti等[5]在中动脉梗阻小鼠模型的大脑中发现梗死后48～72 h，梗死灶的周围血管数增多，提示有新生血管生成，表明脑组织缺氧缺血后存在反应性的新生血管生成。新生血管生成是指由血管内皮细胞出芽形成血管网络的复杂过程，主要包括两种形式：血管发生和血管生成。血管发生是内皮细胞前体形成内皮血管的过程；血管生成是从已有血管出芽形成新的血管的过程[6]。Eph(erythropoietin-producing hepatocyte)受体EphB4及其配体ephrinB2是酪氨酸激酶受体家族中最大的成员[7]。血管生成的早期阶段，ephrinB2特异地表达在动脉内皮细胞上，而EphB4则特异地表达在静脉内皮细胞上，EphB4/ephrinB2这种分布不同提示EphB4/ephrinB2参与原始的血管向动静脉分化的过程；也提示EphB4/ephrinB2参与调节动静脉血管的分布[8-9]。本研究旨在研究缺氧缺血诱导的脑白质损伤大鼠模型脑组织中的微血管密度和ephrinB2及其受体EphB4表达的水平，以确定新生血管的正确分配。

1材料与方法

1.1实验动物与分组新生3日龄清洁级Wistar大鼠60只，性别不限，由佳木斯大学动物实验室提供，生产许可证号：SCXK(黑)-2013-001。60只大鼠按随机数字表法分为实验组和假手术组各30只。

1.2缺氧缺血动物模型制备实验组大鼠于室温下乙醚麻醉，仰卧位固定，颈部周围皮肤消毒，沿正中线作颈部切口，找到并游离右侧颈总动脉，近心端结扎后剪断。该过程持续时间<10 min，剔除出血过多的大鼠。术后2 h将大鼠放入37 ℃恒温密闭箱内，向箱内通氮氧混合气体(94% N2+6% O2)，持续时间4 h，然后取出并放回母鼠笼中进行饲养4 d[10]。这个过程诱导脑室周围白质的主要病变。病理检查可见脑白质内胶质细胞胞体肿胀、小胶质细胞增生、星形胶质细胞肥大、胶质细胞排列紊乱、核固缩变圆，上述脑白质损坏的病理过程和临床床边B超核磁共振等所见到的过程相一致。假手术组大鼠仅游离右侧颈总动脉，不做结扎处理并正常给氧。

1.3测定微血管密度于室温下将制备成功的实验组缺氧缺血大鼠用乙醚麻醉后仰卧位固定在手术台上，用手术用小剪刀剪开大鼠剑突下皮肤、横膈膜及左右肋弓，再沿中线剪开肋骨，使心脏充分暴露。心尖插入灌注针头，灌注液为常温灭菌生理盐水，与此同时剪开右心耳，开放静脉血，待大鼠前肢以及两肺发白以后，将灌注液换成4%多聚甲醛。待灌注大鼠身体僵硬后，开始断头，用大剪刀剪开头皮，暴露头及颈段，分离并去除后颈部肌肉，用弯钳剔除颅骨，过程中注意避免划伤脑组织，暴露大脑后小心剥离，取出脑组织(冠状面上视觉交叉前后3 mm)。在4 ℃下，于4%多聚甲醛/0.1 mol/L磷酸盐缓冲液的固定液中固定12～14 h。脱水、透明、浸蜡、包埋，并制成厚度为10 μm的切片，多聚赖氨酸处理玻片。再在4 ℃下，将切片与抗CD34一级抗体(10 mg/L，北京奥博森生物技术有限公司)一起培养12～14 h，然后在室温下与抗山羊二级抗体(1∶1 000，艾博抗上海贸易有限公司)一起培养2 h。假手术组大鼠做同样处理。脑组织中的微血管密度在200倍镜下进行计数，由于计数微血管的方法在观察者之间存有差异，因此选定两位不知情的独立观察者进行操作。每个被标记的CD34内皮细胞间接触定义为一个微血管，每一组细胞作为一个单独的血管被计数[11]。每个样本取2张切片，每张切片选择相同的3个不重复视野进行微血管计数，求其平均数，作为微血管密度值。

1.4实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定ephrinB2及EphB4的水平用Trizol(上海生物工程有限公司)一步法提取脑组织总的RNA，总RNA的1 μg用于反转录为cDNA，通过实时RT-PCR测定ephrinB2及EphB4的mRNA的水平。用于扩增的引物对分别如下：ephrinB2，上游引物5′-CTG GTA CGA ATG GGA GAA GTT-3′，下游引物5′-GAG CAG CAG CAC CAC CAA-3′；EphB4，上游引物5′-GGC ACG GTA CCA AGG TCT AC-3′；下游引物5′-ACC TCT TCA ATC TTG ACA TAG GAG-3′；β-肌动蛋白，上游引物5′-CTG AAC CCT AAG GCC AAC C-3′，下游引物5′-AGC GCG TAA CCC TCA TAG AT-3′。引物由上海生物工程有限公司合成提供。β-肌动蛋白是作为内部控制的参照基因。使用ABI7500快速系统进行(美国应用生物系统公司)定量RT-PCR测定。扩增条件：95 ℃下cDNA变性2 min(95 ℃ 10 s→60 ℃ 40 s)循环30次。使用2-ΔΔCt方法对相关基因的表达进行分析。

2结果

2.1脑损伤大鼠脑组织中微血管密度比较在缺氧缺血损伤后4 d，即第7日龄大鼠，在脑白质周围区域检测到CD34标记的内皮细胞间接触。实验组微血管密度为3.25±0.97，高于假手术组1.60±0.76，差异有统计学意义(t=-10.37，P<0.05)。

2.2脑损伤大鼠脑组织中新生血管的分配见表1。

表1　大鼠脑组织中血管表达的ephrinB2和EphB4的百分比及其mRNA表达水平比较±s)

注：与假手术组比较，at=-6.33，-3.39，P<0.05；与EphB4比较，bt=20.40，P<0.05。

表1结果表明，假手术组ephrinB2和EphB4的mRNA水平均低于实验组，差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组大鼠脑组织中血管表达的ephrinB2和EphB4的百分比相近，差异无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠脑组织中多数血管表达ephrinB2，少数血管表达EphB4，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

在早产儿大脑中，供应脑白质的动脉末端区域未完全发育，导致血流量减少。由于血流量减少，这些区域在脑白质损伤早产儿脑组织中很容易受损。新生血管生成除了有助于正常脑的发育，还可改善脑损伤组织血流供应，促进神经修复，清除坏死组织，对早产儿脑白质损伤的修复有重要作用[12]。由于免疫反应性CD34主要表达在血管内皮祖细胞中[13]，所以通过CD34标记的微血管密度研究血管内皮祖细胞的增殖，以了解血管的新生情况。本研究中，可观察到缺氧缺血诱导的脑白质损伤大鼠脑组织CD34+细胞首先以单个细胞出现，然后以细胞-细胞接触的形式进行累积，表明有新生血管生成。虽然在假手术组中也有新生血管生成，但是比实验组大鼠脑组织中明显要少。本研究结果表明，缺氧缺血促进CD34+细胞聚集形成微血管系统。

EphB4是一种跨膜酪氨酸激酶蛋白，由Bennett等[14]在人类CD34+骨髓单核细胞和肝癌细胞株Hep3B中克隆出。EphB4的特异性配体EphrinB2是一种跨膜蛋白，于1995年在鼠肾小球系膜细胞株SV40MES13中成功克隆出[15]。EphrinB2除了能和EphB4结合外，还能和EphB1、EphB3等其他的B类受体相结合，但是EphB4只与ephrinB2结合[16]。基因敲除ephrinB2和EphB4导致多数的血管缺陷和胚胎致死[17]。有研究发现，血管生成的最早阶段，动脉和静脉血管内皮分子截然不同，这种不同是通过动脉内皮细胞上ephrinB2的表达及其在静脉内皮细胞上同源受体EphB4的表达区分的[18-19]。ephrinB2和EphB4这种表达的显著不对称性提供了最早区分动、静脉内皮的标记，也提示ephrinB2和EphB4的表达与动静脉的形成有关，被认为有利于防止血管形成过程中动静脉的融合。有研究表明，靶向去除EphrinB2或EphB4的鼠胚导致动、静脉无法界定[20]。本研究中定量分析了脑白质损伤早产大鼠脑组织中ephrinB2和EphB4的表达水平，发现ephrinB2和EphB4在正常早产大鼠脑组织中表达，而在缺氧缺血损伤后上调。在假手术组大鼠大脑组织中，动脉和静脉的百分比相似，然而，在实验组动脉的百分比较多。这些结果表明，新生血管生成主要发生在缺氧缺血诱导的脑白质损伤的动脉。

综上所述，缺氧缺血诱导的脑白质损伤后有新血管生成，并且动脉多于静脉。在缺血性疾病时，为了向缺血的组织提供新的血液供应必然需要的是动脉血管的生成，因为只有动脉血管生成才能提供足够的血液到缺血区。然而目前治疗性血管生成等措施并没有明确动静脉生成的差异。故缺氧缺血诱导的脑白质损伤大鼠模型中的血管生成以及生成血管分配的特异性，可以为促血管新生因子或抗血管新生因子及药物是否具有动脉选择性提供检验的可能，有重要的理论和临床价值。

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(本文编辑：刘颖)

Expression of ephrinB2 and EphB4 in a neonatal rat model of periventricular white matter damage resulting from hypoxia-ischemia

FANGGuiwei,ZHANGLihua,XUHongwei,SUNYing.

TheThirdAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，ChildrenNeuralRehabilitationLaboratoryofJiamusiUniversity，Jiamusi154000，China.

【Abstract】ObjectiveTo evaluate microvessel density (MVD) and the expression of ephrinB2 and its receptor EphB4 in a hypoxia-ischemia induced PWMD rat model.MethodsPostnatal day 3 Wister rats(n=60) were randomly divided into hypoxia ischemia group(group HI),sham operation group(control group),with 30 rats in each group.The HI group underwent permanent ligation of the right common carotid artery then they were exposed to hypoxia (94% N2+6% O2) for 4 hours.For the control group rats,the same surgery was performed except for ligation and exposure to hypoxia.MVD and levels of ephrinB2 and EphB4 were determined at postnatal day 7.ResultsCompared with control group,MVD,ephrinB2 and EphB4 levels were higher in the brains of hypoxic-ischemic rats.Similar percentages of vessels expressed ephrinB2 and EphB4 in control group,but expression of ephrinB2 was greater in brains injured by hypoxia-ischemia.ConclusionFollowing hypoxic-ischemic injury to the rat brain,there were angiogenesis and more arterioles than venules are acquired.

【Keywords】Periventricular white matter damage；Hypoxia-ischemia；Microvessel density； EphrinB2；EphB4；Rat

作者简介：房贵巍(1990-)，女，佳木斯大学康复医学院2013级硕士研究生在读。研究方向：小儿脑性瘫痪的综合康复治疗 通讯作者：张丽华，E-mail：zhanglihua59597@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-3865.2016.03.003

【中图分类号】R364.4

【文献标识码】A

【文章编号】1674-3865(2016)03-0257-04

(收稿日期：2016-02-19)