正交试验法优选吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的闪式提取工艺

郭殷锐，苏雪芬，张广唱，王剑

（广州中医药大学基础医学院，广东广州　510006）



正交试验法优选吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的闪式提取工艺

郭殷锐，苏雪芬，张广唱，王剑

（广州中医药大学基础医学院，广东广州510006）

摘要：【目的】优选吴茱萸药材最佳闪式提取工艺。【方法】采用闪式提取技术，以吴茱萸碱和吴茱萸次碱的得率为指标，采用高效液相色谱法测定。选择乙醇浓度、提取时间和提取电压为考察因素，选用L9（34）正交试验法优选吴茱萸药材最佳闪式提取工艺。【结果】吴茱萸药材的最佳闪提工艺条件为提取电压40 V，提取时间3 min，乙醇浓度体积分数75%和料液比1∶20。【结论】闪式提取吴茱萸药材效率高、时间短，可成为提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。

关键词：吴茱萸/化学；吴茱萸碱/分析；吴茱萸次碱/分析；闪式提取；正交试验；色谱法，高压液相

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa （Juss.）Benth、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.），具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功效，临床常用于治疗厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻等。现代药理研究发现其具有强心、保护心脏、抗心律失常、降压、抗血栓、抗肿瘤、抗过敏和抗炎镇痛等作用［1］。吴茱萸碱（evodiamine，EVO）和吴茱萸次碱（rutaecarpine，RUT）是其主要的有效活性成分，研究［2-3］表明EVO和RUT有良好的强心、降压、抗炎、镇痛功效。闪式提取法也称为闪提法，是近年来发展起来的一种新提取方法，它依据组织破碎提取的原理，利用适当溶剂在闪式提取器里将物料快速破碎至适当粒度，同时通过高速搅拌、超强振动、负压渗滤等功能来达到提取目的。由于一次提取一般在数秒至几分钟之内即可完成，其提取速度为传统方法的百倍以上，因此被称之为闪式提取［4］。本研究采用闪提法提取吴茱萸，并以正交试验法优选，现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器AUI220分析天平（广州湘仪机电设备有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（日本，岛津公司）；QYYS-20A超纯水机（重庆前沿水处理设备有限公司）；JHBE-50闪式提取器（郑州众德实业有限责任公司）；KQ-500VDE台式三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BQ-MW3H实验微波萃取仪（杭州耀博生物科技有限公司）

1.2试药乙醇（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20150212）；乙腈（色谱纯，Dikma，批号：608001003）；四氢呋喃（天津市大茂化学试剂厂，批号：20150206）；冰醋酸（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20140908）；吴茱萸（广州南北行中药饮片有限公司，批号：20150306G352，经广州中医药大学王剑教授鉴定为芸香科植物吴茱萸）。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）；以乙腈—水—四氢呋喃—冰醋酸（体积比41∶59∶1∶0.2）为流动相，流速1 mL/min，柱温30℃，进样量：10 μL，检测波长为225 nm。在此条件下，测得吴茱萸碱峰的保留时间约16.7 min（1号峰），吴茱萸次碱峰的保留时间约为19.5 min（2号峰）。

2.2对照品溶液的制备精密称取吴茱萸碱0.75 mg、吴茱萸次碱0.50 mg，加体积分数75%乙醇定容至10 mL，摇均，超声30 min，0.45 μm微孔滤膜法滤过即得质量浓度吴茱萸碱为75 μg/mL和吴茱萸次碱为50 μg/mL的对照品储备溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称取吴茱萸药材约50.0 g，加20倍量乙醇，闪提3 min，滤过，倒置1 000 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，吸取2 mL用以0.45 μm微孔滤膜过滤即得供试品溶液。

2.4标准曲线的制作精密称定吴茱萸碱（75 μg/mL）和吴茱萸次碱（50 μg/mL）混合对照品溶液，进样量依次为10、20、30、40、50 μL，按上述色谱条件分别测定，记录色谱峰，以峰面积Y对含量X进行线性回归计算，得吴茱萸碱的线性回归方程为：Y = 7309.873X+418542.000，r = 0.999，线性范围为：0.75～3.75 μg；吴茱萸次碱的线性回归方程为：Y= 4572.071X-67912.700，r = 0.991，线性范围为：0.5～2.5 μg。

2.5方法学验证

2.5.1精密度试验按2.1项下色谱条件，取吴茱萸碱和吴茱萸次碱混合对照品溶液连续进样6次，计算相对标准偏差（sR）分别为0.19%、0.32%。

2.5.2稳定性实验按2.1项下色谱条件，取同一供试样品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12 h进样，计算吴茱萸碱和吴茱萸次碱的sR分别为0.46%和0.25%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.3重复性试验按2.1项下色谱条件，取吴茱萸粉末6份，每份50.0 g，精密称定，按2.3项下方法分别制备供试品溶液，测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰面积值，计算吴茱萸碱和吴茱萸次碱的质量浓度的sR分别为0.31%和0.39%。

2.6加样回收率试验精密吸取已测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量的供试液6份，各1 mL，分别准确加入1 mL吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品溶液（吴茱萸碱浓度75 μg/mL，吴茱萸次碱浓度50 μg/mL），重复3次，按照2.1项下色谱条件方法进行测定，计算吴茱萸碱和吴茱萸次碱的平均回收率分别为97.2%和98.6%。sR分别为0.45%和0.58%。

2.7样品测定精密称取吴茱萸药材粉末50.0 g，投入闪式提取器的容器中，然后加入20倍乙醇，按L9（34）正交试验表安排试验，提取完后真空抽滤，倒置1000 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，高效液相色谱仪自动进样10 μL测定，并以外标法计算吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量。吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品混合溶液与供试品溶液的HPLC图谱见图1。

图1　对照品混合溶液（A）和供试品溶液（B）的HPLC图谱Figure 1 HPLC result for mixed solution reference（A）and Fructus Evodiae samples（B）

2.8吴茱萸闪提提取工艺考察

2.8.1提取时间考察精密称取吴茱萸药材50.0 g，以体积分数75%乙醇为提取溶媒，溶媒用量为20倍，提取电压40 V，按提取时间分别为30 s、1 min、2 min、4 min、6 min提取后抽滤，以相应溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取药液1 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，按2.7项下方法测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，结果提取时间为2 min时提取率较高。

2.8.2提取电压考察精密称取吴茱萸药材50.0 g，以体积分数75%乙醇为提取溶媒，溶媒用量为20倍，分别以20、40、60、80、100 V为提取电压，提取时间为1 min，提取后抽滤，以相应溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取药液1 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，按2.7项下方法测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，结果提取电压为40 V时提取率较高。

2.8.3乙醇浓度考察精密称取吴茱萸药材粉50.0 g，分别以体积分数20%、40%、60%、75%、95%乙醇为提取溶媒，溶媒用量为20倍，提取电压为40 V，提取时间为1 min，提取后抽滤，以相应溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取药液1 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，按2.7项下方法测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，结果乙醇浓度为95%的提取率较高。

2.9正交试验选取提取时间、提取电压、乙醇浓度3个因素，吴茱萸药材用量每组50.0 g，料液比为1∶20，以吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率作为评价指标，选用L9（34）正交表进行试验。根据2.8项考察结果设计因素水平见表1，正交试验见表2，方差分析见表3。

实验结果表明：影响吴茱萸碱和吴茱萸次碱总得率的因素依次为A＞C＞B，以D因素为误差项进行方差分析，影响因素A（提取时间）是影响吴茱萸闪提工艺的主要因素，C因素（乙醇浓度）为次要因素，B因素（提取电压）影响不显著，结合直观分析结果，确定正交试验优选制备工艺为A3B2C1，即提取电压40 V，提取时间3 min，乙醇浓度为体积分数75%和料液比1∶20。

2.10最佳工艺条件验证以优选的工艺条件制备3批样品，测定其吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率。验证试验结果见表4。

表1　因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

3　讨论

闪式提取器根据组织破碎原理而设计，其核心部分是破碎刀具和动力部分，通过内外刀刃间歇控制破碎粒度，外刃固定，内刃在高速电机带动下旋转，对中药材产生破碎作用。因其提取速度极快，因此称为闪式提取。传统的溶剂提取法，如煎煮法、回流法、浸渍法等，大多以热为推动力，或依靠浓度差将有效成分提出，存在能耗高、周期长、工序多、收率低、劳动强度大，高温破坏热敏性成分等不足。随着工业化生产规模的扩大，传统提取技术的种种缺陷，越来越制约了人们对中药资源的开发利用。闪式提取具有提取温度低、速度快、操作简单的特点，对提取热敏性物质更具有优势，在中药提取和天然化学成分研究等方面具有广泛的应用前景，将为中药研究开辟一个新的途径。闪式提取不仅适用于不同质地的动植物材料，还可有效地应用于不同类型的化学物质。目前已经应用且已取得成功经验的有鞣质类、多酚类、黄酮类、皂苷类、萜类、生物碱类等生物活性成分。中药在临床上大多是以复方的形式应用，闪式提取所具有高效、快速、节能、环保的特点，将为中药复方的提取工艺研究带来极大的便利，但将其应用于中药方剂的提取仅刚刚开始，创新研究的空间和前景很大［5-8］。

表2　正交试验结果与直观分析Table 2 Results and analysis of L9（34）orthogonal test　（N=3）

本研究结果表明：闪式提取吴茱萸药材在提取电压40 V，提取时间3 min，乙醇浓度体积分数75%和料液比1∶20的条件下，吴茱萸碱的得率为16.1 mg/g，吴茱萸次碱的得率为7.5 mg/g。另取同批药材等量，依据娄方明等［8］记载的最佳微波提取条件进行提取，所得吴茱萸碱得率为8.22 mg/g，吴茱萸次碱得率为4.81 mg/g；依据甄攀等［9］采用超声提取的最佳条件进行提取，所用溶剂改为体积分数75%乙醇而不使用乙酸乙酯，所得吴茱萸碱得率为6.43 mg/g，吴茱萸次碱得率为3.33 mg/g。闪式提取可以省却药材干燥和粉粹的步骤，对于一些难以干燥以及质地稍软的中药材有特殊的优势，且提取效率和时间都明显优于传统方法。综上所述，闪式提取为吴茱萸药材的较佳提取方法。

从本研究结果可以发现，提取时间是影响闪式提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率最显著的因素，主要是因为当时间过长，药材被打成较细的粉，药粉越细可能就越容易与药效成分发生物理吸附作用，影响有效成分的释放，所以闪式提取要掌握好最佳的提取时间。

参考文献：

［1］龚慕辛，王智民，张启伟，等.吴茱萸有效成分的药理研究进展［J］.中药新药与临床药理，2009，20（2）：183.

［2］Kobayashi Y，Hoshikuma K，Nakano Y，et al.The positive inotropic and chronotropic effects of evodiamine and rutaecarpine，indolquinazoline alkaloids isolated from the fruits of Evodia rutaecarpa，on the guinea -pig isolated right atria：possible involvement of vanilloid receptors［J］.Planta Med，2001，67 （3）：244.

［3］Wang G J，Wu X C，Chen C F，et al.Vasorelaxing action of rutaecarpine：effects of rutaecarpine on calcium channel activities in vascular endothelial and smooth muscle cells［J］.J Pharmacol Exp Ther，1999，289（3）：1237.

［4］刘延泽.植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践［J］.中国天然药物，2007，5（6）：401.

［5］吴冬梅.闪式提取器在中药研究中的应用［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12（7）：34.

［6］李精云，刘延泽.组织破碎提取法在中药研究中的应用进展［J］.中草药，2011，42（10）：2145.

［7］黄越燕，谭荣德.闪式提取技术在中药成分提取中的研究进展［J］.中国医院药学杂志，2015，35（1）：83.

［8］娄方明，黄燮南，钱静.微波提取吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的工艺研究［J］.遵义医学院学报，2009，32（2）：599.

［9］甄攀，张荣山，白雪梅，等.吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取条件研究［J］.中国药学杂志，2005，42（2）：99.

【责任编辑：黄玲】

·基础研究·

Optimization of Flash Extraction Process for Evodiamine and Rutaecarpine from Fructus Evodiae by Orthogonal Test

GUO Yinrui，SU Xuefen，ZHANG Guangchang，WANG Jian
（Basic Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To optimize the flash extraction process for evodiamine and rutaecarpine isolated from Fructus Evodiae.Methods We used the flash extraction process to extract evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae，and performed high performance liquid chromatography（HPLC）with their yields as the observation indexes.Selecting ethanol concentration，extraction time and extraction voltage as the examination factors，we adopted L9（34）orthogonal test to screen the optimum flash extraction process.Results The optimum flash extraction process conditions were as follows：extracting voltage at 40 V，extracting for 3 min，ethanol at the volume fraction of 75%，and solid to liquid ratio being 1∶20.Conclusion The flash extraction process for Fructus Evodiae medicinal materials has the advantage of higher yield and shorter time，and can be used for extracting evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae .

Key words：Fructus Evodiae/chemistry；evodiamine/analysis；rutaecarpine/analysis；flash extraction；orthogonal test；chromatography，high performance liquid

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1007-3213（2016）03 - 0380 - 04

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．023

收稿日期：2015-11-07

作者简介：郭殷锐（1988-），男，在读硕士研究生；E-mail：75706868@qq.com

通讯作者：王剑，男，博士，硕士研究生导师；E-mail：zswj@gzucm.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：81173150）