机械牵张刺激下大鼠皮肤再生的关键基因筛选

高宇　汪景　余庆雄　单圣周　李青峰



机械牵张刺激下大鼠皮肤再生的关键基因筛选

高宇汪景余庆雄单圣周李青峰

【摘要】目的明确机械牵张刺激下大鼠皮肤再生相关基因表达谱的变化，并筛选出其中的关键基因。方法建立大鼠皮肤扩张模型，以未扩张皮肤为对照，以注水量不同分组取材。分别是：对照组（con）、扩张器最终注水60 mL组（exp60）、扩张器最终注水120 mL组（exp120）、扩张器最终注水180 mL组（exp180）。取材后一部分样本切片行免疫荧光染色，荧光标记增殖标记物Ki67，绘制皮肤细胞增殖曲线。另一部分样本行基因芯片检测，检测mRNA表达谱的变化，并利用t检验和差异表达的倍数变化（FC值）筛选出关键基因。筛选出皮肤再生的关键基因后，用PCR方法验证以确认该基因的表达量，及其与皮肤增殖之间的关系。结果免疫荧光染色显示，增殖标记物Ki67在各组的表达量由高到低依次是：con、exp180、exp60和exp120。本研究筛选出不同机械牵张刺激下大鼠皮肤再生的11个差异基因，分别为：Myh1、Myh2、Myh3、Myh4、Car6、Pi15、Apt12a、Mt1a、Cthrc1、Rsad2和IGF-BP5。其中IGF-BP5和对照组的皮肤内表达相比为下调基因；PCR验证得出，IGF-BP5在各组的表达量由高到低依次是：exp120、exp60、exp180和con。结论机械牵张刺激下，随着扩张时间及扩张量的增加，大鼠皮肤再生呈现早期皮肤细胞增殖加速，中期增殖活跃，后期增殖减缓的趋势；且IGF-BP5可能为影响机械牵张刺激下大鼠皮肤再生的关键基因。

【关键词】皮肤扩张机械牵张皮肤再生基因芯片

作者单位：200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

皮肤软组织扩张就是将医用硅胶制作的软组织扩张器埋植于皮下，并定期向扩张囊内注入生理盐水，对表面皮肤组织增加压力，通过生长和弹性扩张，使皮肤发生层进行分裂增殖，以增加额外的皮肤用于对缺损进行修复［1］。该手术可为患者提供质地、色泽、厚薄以及毛发分布等同周围组织相似的组织，并进一步避免产生新的瘢痕或畸形［2-5］。它与传统烧伤整形外科修复手段，如植皮、远位皮瓣等相比，保留了供区皮肤组织的特征，克服了供区发生再缺损的弊端［6-8］。

但是，常规扩张能提供的皮肤有限，常常不能满足大面积缺损修复的需要；反复扩张又使得皮肤质地改变、扩张效率下降，并增加了患者经济和精神负担；超量扩张虽能获得较多的扩张量，但扩张周期长，破溃、感染等并发症的发生率也随之增高［9-12］。因此，促进皮肤的再生能力、提高扩张效率、缩短扩张时间一直是研究的热点之一。

有研究认为，罂粟碱、雌三醇、A型肉毒毒素、二甲亚砜、碱性成纤维细胞生长因子、钙通道阻滞剂和骨髓间充质干细胞等能够提高扩张效率［13-20］。尽管这些方法在实验研究中取得了进展，但由于毒副作用、维持时间、给药途径和实际效果等因素限制，临床效果并不令人满意。临床上尚缺乏一种能有效促进皮肤再生并提高扩张效率的方法。尽管我们已经从组织和细胞水平上详细了解了扩张过程中机体的各种变化，但基因水平上尚缺乏系统全面的认识，因而不能明确扩张过程中的关键分子并针对这些关键分子实行有效的干预。

本研究根据扩张皮肤中mRNA的变化，通过基因芯片分析技术及分子生物学技术，尝试明确扩张皮肤再生相关基因表达水平上的变化，找出其中的关键靶基因，为进一步的干预实验筛选靶点。

1　材料与方法

1.1实验动物及材料

雄性SD大鼠，7～8周龄（我院SPF级动物实验中心提供）；10 mL皮肤软组织扩张器（广州万和整形材料有限公司）；mRNA芯片采用Affymetrix GeneChip Rat Gene 2.0 ST Array基因芯片平台（上海欧易生物医学科技有限公司）。

1.2建立扩张模型

大鼠麻醉，背侧皮肤备皮。在大鼠颈部后方作3 cm切口，切开皮肤、皮下组织至深筋膜浅层。然后向头侧及尾侧剥离形成腔隙。其中尾侧剥离范围为3 cm×6 cm。向头侧腔隙中放置扩张器注射壶，并将扩张器植入尾侧剥离腔隙，术毕，缝合切口。术后1周待切口愈合后，向扩张器内注入10 mL无菌生理盐水，每周3次（周一、周三、周五各1次）。实验分4组，目的注水量分别为0、60 mL、120 mL和180 mL，标记为con、exp60、exp120、exp180四组，每组3个标本，共12只大鼠。

1.3免疫荧光染色

使用abcam抗体进行免疫荧光染色，检测各组增殖标记Ki67，荧光显微镜下观察并拍摄标记情况，统计Ki67阳性率以反映皮肤再生情况。

1.4基因芯片

RNA样本由上海欧易生物医学科技有限公司，进行mRNA芯片的杂交数据读取和正态化工作。样品总RNA利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并经Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）检测RNA完整性。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成cRNA，接着对cRNA进行第二轮反转录合成cDNA，片段化并与生物素标记后与芯片杂交，洗脱和染色后利用Affymetrix Scanner 3000（Affymetrix）扫描得到原始图像。

1.5差异基因的筛选

原始图像采用Expression Console软件（version1.3.1，Affymetrix）处理提取原始数据和RMA标准化处理。利用Genesrping软件（version 12.5，Agilent Technologies）进行后续处理。差异基因利用t检验的P值和倍数变化值进行筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P≤0.05。接着，对差异基因利用GO和KEGG（Kyoto Encyclope dia of Genes and Genomes）富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。分别分析出exp60 VS control，exp120 VS control，exp180 VS control三组数据分别的差异基因和共同差异基因，根据共同差异基因的不同功能，我们选定参与细胞组成的基因，进行PCR验证，确认其表达趋势和Ki67的阳性率趋势是否一致，从而确认该基因对于牵张刺激下皮肤再生的作用。

1.6PCR实验步骤

存于液氮中的组织或细胞用trizol进行mRNA提取；提出的mRNA用MMLV系统进行逆转录得到CDNA；cDNA可在real Time PCR中进行内参的验证，来验证提取和转录的效率，确定能进行实验的样本；最后进行real time PCR的扩增步骤，判断实验数据，进行计算（图1）。

图1　引物信息Fig. 1 Information of primer

2　结果

2.1不同扩张时间对皮肤细胞增殖的影响

荧光显微镜检测增殖标记Ki67显示，随着扩张器注水量的增多，表皮厚度逐渐增厚（图2，3）。表皮细胞的增殖情况可用Ki67的阳性率来表示。结果显示，4组中Ki67的阳性率从高到低依次为exp120、exp60、exp180、con（图4）。说明在注水量达120 mL时，大鼠皮肤细胞增殖最活跃，注水量达60 mL时，处于增殖上升期，注水量在120～180 mL期间，处于增殖减缓期。

图2　各组免疫荧光观察增殖标记Ki67Fig. 2 Immunohistochemical observation of proliferation marker Ki67 in each group

图3　各组表皮厚度Fig. 3 Thickness of epidermis in each group

图4　各组Ki67阳性率Fig. 4 Positive rate of proliferation marker Ki67 in each group

2.2基因芯片分析结果

将3组实验组与对照组进行比较，数据归一化处理，初筛基因。满足上调或者下调倍数变化值≥2.0 且P≤0.05条件的基因，分别有67个（其中17个上调基因，50个下调基因）、143个（其中59个上调基因，84个下调基因）、94个（其中5个上调基因，89个下调基因）（表1）。

表1　60 vs con、120 vs con、180 vs con的差异基因总数统计Table 1 Summary of discrepant genes of 60 vs con，120 vscon and 180 vs con

将3组数据的差异基因进行重合，从304个备选差异基因中，根据基因功能，分为四种类型：细胞组成、生物过程、分子功能和KEGG通路。我们选定参与细胞组成的基因，从中筛选出11个表达存在显著性差异的共同基因（FC＞2，P＜0.05），其中，5个（45.45%）上调基因，6个（54.55%）下调基因（表2）。

表2　60 vs con、120 vs con、180 vs con的共同差异基因Table 2 Common examples of discrepant genes of 60 vscon，120 vs con and 180 vs con

2.3定量PCR验证结果

在芯片筛选出的参与细胞组成的差异基因中，根据已有相关文献报道结果，我们对其中一个基因IGF-BP5进行定量PCR验证，发现与正常未扩张皮肤相比，IGF-BP5在扩张皮肤中表达下降。PCR验证结果显示，在con、exp60、exp120和exp180这四组中，IGF-BP5表达量由多到少，依次排序为con、exp180、exp60、exp120（图5）。

图5　各组IGF-BP5表达量Fig. 5 Expression of IGF-BP5 in each group

3　讨论

由于皮肤扩张是一个长期的过程，在扩张的不同阶段随着炎症血流动力学和生物力学等因素的变化，细胞的生理状态也存在着不同的变化［21-26］，因此需要进行时间序列的基因芯片实验，才能完整揭示扩张过程中基因水平的各种变化。本实验免疫荧光染色显示，各组中增殖标记Ki67的表达量由高到低依次是exp120、exp60、exp180和con。本研究首次明确了SD大鼠皮肤随着扩张器注水量增多的不同时间点的基因芯片数据，并筛选出参与细胞组成的11个差异基因，分别为：Myh1、Myh2、Myh3、Myh4、Car6、Pi15、Apt12a、Mt1a、Cthrc1、Rsad2和IGF-BP5。其中，IGF-BP5和对照组的皮肤内表达相比为下调基因，PCR验证得出，IGF-BP5在4组中的表达量由高到低依次是exp120、exp60、exp180和con，符合IGF-BP5作为下调基因的特点。因此我们认为，在机械牵张刺激下，随着扩张时间及扩张量的增加，大鼠皮肤再生呈现早期皮肤细胞增殖加速，中期增殖活跃，后期增殖减缓趋势；且IGF-BP5可能为影响机械牵张刺激下大鼠皮肤再生的关键下调基因。

Pilewski等［27］在系统性纤维化病人纤维化皮肤的原代成纤维细胞中发现，IGF-BP5的mRNA和蛋白表达水平增高；Yasuoka等［28-29］报道，小鼠模型中IGF-BP5通过增厚真皮结缔组织厚度、增加胶原和纤连蛋白的沉积来诱导皮肤的纤维化。2014年，他们又发现，IGF-BP5诱导皮肤纤维化的机制可能是通过DOK5调控细胞外基质的合成［30］。然而，Carolyn等［31］发现，IGF-II∶VN（vitronectin）和IGF-I∶IGFBP-5∶VN的复合体，可能有增强表皮细胞的迁徙和增殖的功能，尤其在伤口愈合和皮肤再生过程中。其中，IGF-BP5的作用是使IGF-1和VN的连接更容易。Turchi等［32］证实，在烧伤和外伤的愈合过程中，IGF∶VN复合体能够促进表皮细胞的增殖和迁徙。关于IGF-BP5诱导皮肤纤维化和我们研究显示的IGFBP5抑制牵张刺激下皮肤再生的关系，仍需进一步研究。

本研究尚存在一定的局限，实验方法上面，我们研究的是取样时某个扩张量下的皮肤，所以只能大概确定皮肤再生的趋势，不够精确，以后的实验中可以更加细化时间段。其次，虽然说明了IGF-BP5可能是抑制皮肤再生的关键基因，但是，机制有待进一步明确。未来的研究将会着力于完善相关数据，追踪本研究发现的其他关键基因，进一步明确其调控皮肤扩张的机制。

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·综述·

·论著·

Key Gene Screening of Skin Regeneration Under Mechanical Stretch Stimulation in Rats

GAO Yu，WANG Jing，YU Qingxiong，SHAN Shengzhou，LI Qingfeng. Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China. Corresponding author: LI Qingfeng（E-mail: dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）.

【Abstract】Objective To determine the expression changes of skin regeneration-related key genes under mechanical stretch stimulation in rats and to screen key genes. Methods Skin expansion model was established and skin samples were harvested：the unexpanded control group（con），water-injected 60 mL group（exp60），water-injected 120 mL group（exp120）and water-injected 180 mL group（exp180）. Immunohistochemical staining was implemented in the sliced the sample，staining proliferation marker Ki67. According to that，the trend curve of Ki67 positive rate of samples was drawn. Gene Chip was also undertaken to reveal the gene expression changes during expansion process. T test and fold change of differential expression were applied to screen key genes. Then PCR was used to confirm the relationship between the expression of the key gene and the proliferation of skin. Results Immunofluorescence staining showed that，the expression of the proliferation marker Ki67 descending order is con，exp180，exp60，exp120. This study screened 11 skin regeneration-related key genes of rats under different mechanical stretch stimulation：Myh1，Myh2，Myh3，Myh4，Car6，Pi15，Apt12a，Mt1a，Cthrc1，Rsad2，IGF-BP5. Compared to the expression of control group，IGF-BP5 was a down-regulated gene. PCR showed that the expression of IGF-BP5 descending order was：exp120，exp60，exp180，con. ConclusionUnder mechanical stretch stimulation，with the increasing time of expansion and amount of water injected，skin regeneration of rats shows accelerated proliferation at early stage，active proliferation in the mid-term and tendency to slow down the proliferation in the later period；IGF-BP5 may be a key regeneration-related gene of rats under mechanical stretch stimulation.

【Key words】Skin expansion；Mechanical stretch；Skin regeneration；Gene chip

【中图分类号】R622+.l

【文献标识码】A

【文章编号】1673－0364（2016）02－0107－05

基金项目：国家自然科学基金（NO.81230042）。

通讯作者：李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.005

收稿日期：（2016年3月1日；修回日期：2016年3月22日）