17β雌二醇对人皮肤成纤维细胞胶原和弹性蛋白合成的影响

孟飞　王丽　王彦　郗林鹤　张洁



17β雌二醇对人皮肤成纤维细胞胶原和弹性蛋白合成的影响

孟飞王丽王彦郗林鹤张洁

【摘要】目的探讨不同浓度17β雌二醇（17β-estrogen，17β-E2）在不同时间点对体外培养的人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblast，hSFB）合成胶原及弹性蛋白的影响。方法体外培养hSFB，分别加入不同浓度的17β-E2（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L），继续培养24 h、48 h、72 h，在不同时间点分别提取相应的RNA，RT-PCR检测经17β-E2处理后的hSFB的Ⅰ、Ⅲ型前胶原及原弹性蛋白mRNA的表达情况。结果RT-PCR结果显示，17β-E2处理组较空白对照组前胶原及原弹性蛋白表达水平在24 h没有变化，48 h时明显上调，72 h时呈现下降；在48 h时，17β-E2对前胶原与原弹性蛋白的影响，10-10mol/L组上调作用较其他浓度组明显；在48 h时，同一浓度17β-E2对前胶原蛋白的促进作用较原弹性蛋白明显，尤其是对Ⅲ型的促进作用更强。结论17β-E2对胶原及弹性蛋白的合成有一定的促进作用，不同时间、不同浓度对其影响不同，在10-10mol/l、48 h时作用最强。

【关键词】17β雌二醇人皮肤成纤维细胞胶原蛋白弹性蛋白

作者单位：261000山东省潍坊市潍坊医学院（孟飞）；250014山东省济南市山东大学附属千佛山医院（孟飞，王彦，郗林鹤，张洁）；261000山东省潍坊市潍坊医学院附属医院生殖中心（王丽）。

绝经期后女性皮肤易变薄、弹性变差，皮肤中胶原及弹性蛋白流失增加，这与Ⅰ、Ⅲ型胶原比例倒置有关，是由于体内雌激素水平下降引起。临床上采用雌激素替代治疗（Hormone replacement therapy，HRT）后，发现患者皮肤状态明显改善，皮肤增厚、弹力增加，胶原量及弹性蛋白合成增加。而分泌胶原、弹性蛋白的是真皮中的成纤维细胞，因此，我们体外培养hSFB，研究不同浓度17β雌二醇（17β-E2）对合成胶原及弹性蛋白的影响，以提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源

标本取自行上睑皮肤松弛矫正手术的绝经后女性的上睑皮肤标本。

1.1.2主要试剂和仪器

Ⅰ型胶原酶（索莱宝生物技术公司）；胰酶、胎牛血清、DMEM（Gibco公司）、17β雌二醇粉剂（Sigma公司）；RNA提取试剂盒（康为试剂生物有限公司）；反转录试剂、SYBR Green（台湾东洋纺股份有限公司）。荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。1.2方法

1.2.1hSFB的分离与培养

皮肤标本用含双抗的Hanks液彻底洗净，分离并剪碎真皮组织，用含1%的Ⅰ型胶原酶DMEM液37℃、5%CO2孵育箱消化4～6 h，200钼筛网过滤收集细胞，离心，含15%FBS的DMEM液重悬细胞，接种于25 cm培养瓶；以1∶3比例传代培养。

1.2.2细胞种板与药物处理

第4代细胞接种于6孔板，设5个雌二醇浓度组（浓度分别为：10-7，10-8，10-9，10-10，10-11mol/L）和1个对照组，每个浓度设2个复孔，细胞贴壁后24 h，分别向6孔板中加入含不同浓度雌激素的15%FBS 的DMEM培养液，继续培养24 h、48 h和72 h。

1.2.3细胞总RNA的提取及逆转录

待药物作用24 h、48 h、72 h后，根据RNA提取试剂盒说明书提取细胞中的总RNA，紫外线分光光度计测定A260/A280比值及RNA浓度；将RNA反转录成cDNA，逆转录体系总体积16 μL：RT PrimerScript Buffer 4 μL，RT Enzyme 1 μL，RT Primer MIX 1 μL，无RNA酶水10 μL。RNA 4 μL 65℃变性5 min，加反应逆转录体系16 μL后37℃15 min，98℃5 min，所得cDNA于-80℃保存。

1.2.4RT-PCR检测mRNA水平的表达

配制反应体系，总体积10 μL：cDNA 1 μL， SYBR GREEN 5 μL，上下游引物各1 μL（表1），无菌去离子水2 μL。PCR扩增循环进行如下：95℃预变性2 min，95℃变性10 sec，60℃退火31 sec，72℃延伸30 sec，40个循环，72℃延伸3 min。每个样品设3个复孔，同时进行目标基因和GADPH mRNA水平测定，PCR产物进行熔解曲线分析。目的基因mRNA的相对表达水平通过GAPDH mRNA水平进行确定。

1.2.5图像分析与数据处理

用GAPDH为内参照，对Ⅰ、Ⅲ型胶原及原弹性蛋白mRNA进行定量分析，采用SPSS17.0统计软件进行方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同时间点17β-E2的影响

前胶原与原弹性蛋白mRNA的表达情况（图1～3）显示，17β-E2处理组Ⅰ、Ⅲ型前胶原及原弹性蛋白的mRNA合成，24 h时17β-E2上调作用不明显，48 h时上调作用明显增加，72 h时对合成的促进作用较48 h下降。因此，我们推测，17β-E2可促进成纤维细胞分泌合成胶原及弹性蛋白，但作用大小可能与作用时间相关，48 h为17β-E2最佳作用时间（P＜0.05）。

2.2不同浓度17β-E2的影响

根据48 h时各组前胶原与原弹性蛋白mRNA的表达情况可以看出，一定浓度范围内（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L），以10-10mol/L为17β-E2促进HSFB合成Ⅰ、Ⅲ型前胶原和原弹性蛋白的最有效浓度，并且浓度大小与促进合成作用不成正比（P＜0.05），而24 h、72 h时无此规律。

2.3同一浓度17β-E2对Ⅰ、Ⅲ型前胶原和原弹性蛋白合成的影响的比较

48 h时结果显示，同一浓度17β-E2对Ⅰ、Ⅲ型前胶原和原弹性蛋白合成均有明显的上调作用，但上调作用大小依次为III型前胶原、I型前胶原和原弹性蛋白，表明同一浓度17β-E2对Ⅲ型前胶原合成的调节最强、原弹性蛋白最弱。

表1　引物序列Table 1 Primer sequence

图1　各组各时间点Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平Fig. 1 The mRNA expression of procollagen Ⅰin each group at different time point

图2　各组各时间点Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平Fig. 2 The mRNA expression of procollagen Ⅲin each group at different time point

图3　各组各时间点原弹性蛋白mRNA的表达水平Fig. 3 The mRNA expression of tropoelastin in each group at different time point

3　讨论

女性绝经期后，皮肤衰老加快，皮肤中胶原总含量逐渐减少，特别是可溶性胶原含量下降明显，Ⅰ、Ⅲ型胶原比例逐渐倒置；弹力纤维减少退化，胶原和弹性纤维排列渐趋紊乱；皮肤含水量渐少，出现干燥、松弛、变薄、皱纹形成、色素脱失或沉着等表现［1-3］。

临床上治疗更年期综合征常应用雌激素替代治疗，在改善更年期症状的同时，患者的皮肤变好，皮肤厚度、弹性和保湿性均增加［4-6］，而雌二醇是进行雌激素替代治疗的常用药物。成纤维细胞是雌激素作用的靶器官之一，是真皮的主体细胞，其分泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分，与成纤维细胞一同构成了真皮的主体［7］。研究证明，在皱纹形成过程中，成纤维细胞是主要的效应细胞，其生物学特性的改变决定影响了皮肤老化程度［8］。因此，大量研究通过改善衰老皮肤的成纤维细胞的生物学特性，促进胶原蛋白及弹性蛋白的增加以延缓皮肤衰老。

Sator等［9］将雌二醇外用于面部6个月，发现治疗组皮肤的湿度和弹力增加，皮肤的紧张性增加，皱纹变浅，且未见激素引发的不良反应。Patriarca等［10］的研究表明，经HRT治疗后的绝经妇女，局部应用雌激素后面部真皮厚度及胶原数量明显增加，而血清激素水平无明显变化。Hosokawa等［11］应用苯甲酸雌二醇对小鼠的成纤维细胞进行培养，发现其能促进胶原合成，加速胶原成熟，抑制胶原降解。

本实验对人皮肤成纤维细胞进行体外培养，加入不同浓度的雌二醇与空白对照组比较。有文献报道，雌激素可促进hSFB的增殖，促增殖效应最强的有效浓度为10-10mol/L［12］，促进胶原合成的最佳浓度为10-9mol/L［13］。因此，我们设计不同浓度梯度（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L）进行比较研究。另有文献显示，雌二醇对体外培养的成纤维细胞在6 h时与对照组比较，Ⅰ型前胶原mRNA的水平几乎无改变。因此，我们适当延长了雌二醇的作用时间，设置为3个不同的时间点（24 h、48 h和72 h）［14］。实验结果显示，17β雌二醇对胶原和弹性蛋白有一定的促进合成作用，而且胶原的合成与雌二醇浓度不成正比，在10-10mol/L，48 h时促进作用最强。

参考文献

［1］Singh R，Barden A，Moil T，et al. Advanced glycation end-products：a review［J］. Diabetologia，2001，44（2）：129-146.

［2］Shah MG，Maibach HI. Estrogen and skin. An overview［J］. Am J Clin Dermatol，2001，2（3）：143-150.

［3］Brincat M，Versi E，Moniz CF，et al. Skin collagen changes in postmenopausal women receiving different regimens of estrogen therapy［J］. Obstet Gynecol，1987，70（1）：123-127.

［4］Sator PG，Sator MO，Schmidt JB，et al. A prospective，randomized，double-blind，placebo-controlled study on the influence of a hormone replacement therapy on skin aging in postmenopausal women［J］. Climacteric，2007，10（4）：320-334.

［5］Sumino H，Ichikawa S，Abe M，et al. Effects of aging and postmenonpausal hypoestrogenism on skin elasticity and bone mineral density in Japanese women［J］. Endocr J，2004，51（2）：159-164.

［6］Sator PG，Schmidt JB，Sator MO，et al. The influence of hormone replacement therapy on skin aging：a pilot study［J］. Maturitas，2001，39（1）：43-55.

［7］Obeid LM，Venable ME. Signal transduction in cellular senescence［J］. J Am Geriatr Soc，1997，45（3）：361-366.

［8］王曦，李利.成纤维细胞与皮肤老化［J］.中国美容医学，2005，14 （2）：243-245.

［9］Sator PG，Schmidt JB，Rabe T，et al. Skin aging and sex hormones in women -clinical perspectives for intervention by hormone replacement therapy［J］. Exp Dermatol，2004，13 Suppl 4：36-40.

［10］Patriarca MT，Goldman KZ，Dos Santos JM，et al. Effects of topical estradiol on the facial skin collagen of postmenopausal women under oral hormone therapy：a pilot study［J］. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2007，130（2）：202-205.

［11］Hosokawa M，Ishii M，Inoue K，et al. Estmgen induces different responses in demal and lung fibroblasts：special reference to collagen［J］. Connect Tissue Res，198l，9（2）：115-120.

［12］左俊，李勤，陈葵，等.雌激素对人皮肤成纤维细胞增殖与迁移的影响［J］.中华医学美学美容杂志，2013，19（3）：207-210.

［13］张东妍，康尔恂.17β-雌二醇对人皮肤成纤维细胞分泌透明质酸和胶原的影响［J］.中华皮肤科杂志，2010，43（6）：423.

［14］Qu L，Abe M，Yokoyama Y，et al. Effects of 17β-estradiol on matrix metalloproteinase-1 synthesis by human dermal fibroblasts ［J］. Maturitas，2006，54（1）：39-46.

·论著·

Effects of 17β-estradiol on the Synthesis of Collagen and Elastin in Cultured Human Skin Fibroblasts

MENG Fei1，2，WANG Li3，WANG Yan2，XI Linhe2，ZHANG Jie2. 1 Weifang Medical University，Weifang 261000，China；2 Qianfoshan Hospital，Shandong University，Ji'nan 250014，China；3 Reproductive Center，Weifang Medical School Affiliated Hospital，Weifang 261000，China. Corresponding author: WANG Li（E-mail: wfwlstar@163.com）；WANG Yan（E-mail: wangyandr@126.com）.

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of 17 beta estradiol（17β-E2）with different concentrations on the synthesis of collagen and elastin of cultured human skin fibroblasts（hSFB）at different time points in vitro. Methods Human fibroblasts were cultured with different concentrations of 17β-E2（10-7，10-8，10-9，10-10，10-11mol/L）for 24 hours，48 hours and 72 hours. The corresponding RNA was extracted at respectively time points，then mRNA expression of typeⅠprocollagen，typeⅢprocollagen and tropoelastin were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）method. Results The mRNA expressions of procollagenⅠ，procollagenⅢand tropoelastin were not changed in 24 hours，but up-regulated in 48 hours and declined in 72 hours by 17β-E2 stimulations. On 48 hours，the synthesis of procollagen and tropoelastin stimulated with 10－10mol/L of 17β-E2 was significantly increased，compared with the other concentrations. On 48 hours with the same concentration，the up-regulated effect on synthesis of procollagen and tropoelastin was different，the effect on procollagen was stronger than tropoelastin，especially procollagenⅢ. Conclusion17-E2 has a certain role in promoting the synthesis of collagen and elastin，though the influence is different according to different culture time and different concentration，and the most effective concentration and culture time are 10-10mol/L and 48 hours respectively.

【Key words】17β-estrogen；Human skin fibroblast；Collagen；Elastin

【中图分类号】R622+.l

【文献标识码】A

【文章编号】1673－0364（2016）02－0111－03

通讯作者：王丽（E-mail：wfwlstar@163.com）；王彦（E-mail：wangyandr@126.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.006

收稿日期：（2015年12月2日；修回日期：2015年12月27日）