LC-MS/MS 测定小鼠肾脏中甘草次酸的含量

封　聪，霍韬光，王守云，张颖花，吴　辉，姜　泓*

(1.中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122；　2. 中国医科大学 药学院，辽宁 沈阳 110122)



LC-MS/MS 测定小鼠肾脏中甘草次酸的含量

封聪1，霍韬光1，王守云2，张颖花1，吴辉1，姜泓1*

(1.中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122；2. 中国医科大学 药学院，辽宁 沈阳 110122)

摘要：建立LC-MS/MS测定小鼠肾脏中甘草次酸含量的方法. 本法以原儿茶酸为内标物质，采用多反应监测模式，对肾脏中甘草次酸进行定量研究. 结果所建方法灵敏、精确、快速、线性范围宽，可用于甘草次酸与雄黄联合用药小鼠肾脏中甘草次酸的含量测定.

关键词：液相色谱质谱联用；甘草次酸；原儿茶酸；含量测定

甘草次酸(glycyrrhetinic acid)是甘草的主要有效成分甘草酸及其盐(即甘草甜素)的代谢产物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节、保护肝细胞、抗氧化及肾上腺皮质激素样作用，具有明显增强肝肾的解毒功能和脑保护作用[1-3]. 近年来，对生物样品中甘草次酸含量测定方法的研究时有报道，但多集中在对血浆样品中甘草次酸含量测定上[4-6]，而有关组织样品中测定甘草次酸含量的方法少有报道. 本研究将采用二级质谱扫描的方法对肾脏中甘草次酸进行定量分析，并首次选用原儿茶酸作为内标物质，建立LC-MS/MS测定小鼠肾脏中甘草次酸含量的方法. 并将该法应用于甘草次酸对雄黄解毒的研究中，为甘草与雄黄配伍机制的研究提供理论依据和实验数据.

1实验部分

1.1仪器与试剂

1290液相色谱-6420 三重串联四级杆质谱联用系统(美国，Agilent)，ER-182A全自动电子天平(十万分之一) (日本A&D公司)；3K-18型超速低温冷冻离心机(Sigma公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；Easypure纯水系统(美国，Barnstead公司).

甘草次酸(上海源叶生物科技有限公司)，原儿茶酸(中国药品生物制品检定所，809-9201)，甲醇(质谱纯，美国Sigma公司)，乙腈(质谱纯，美国Sigma公司).

1.2实验方法

1.2.1甘草次酸标准系列溶液和内标溶液的配制

精密称取甘草次酸对照品适量，用甲醇溶解，得浓度为322.6 mg/L的甘草次酸储备液. 精密量取储备液适量，配成浓度为67.20、134.4、336.0、672.0、1 344、6 720 μg/L的系列标准对照溶液，4 ℃保存备用.

精密称取原儿茶酸适量，用甲醇溶解，得浓度为920.0 μg/L的原儿茶酸储备液. 临用前精密量取储备液适量，用甲醇稀释成浓度为184.0 μg/L溶液，作为内标溶液，4 ℃保存备用.

1.2.2色谱条件和质谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(Agilent 4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈-水(体积比80∶20)，流速为1 mL/min，进样量10 μL.

电喷雾(ESI)离子源，负离子模式，扫描方式为多反应检测(MRM)，甘草次酸m/z为469.4→425.4，原儿茶酸m/z为153.1→109.1. 毛细管电压为3 500 V，离子源温度为330 ℃，甘草次酸和原儿茶酸的毛细管出口电压分别为200 V和100 V，碰撞电压(CE)分别为38 V和15 V；保护气流量10 L/min.

1.2.3样品溶液的制备

精密称取肾脏组织200 mg，加入乙腈1.0 mL，超声破碎2 min，然后加入浓度为184 μg/L的原儿茶酸内标溶液200 μL，混匀，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)10 min. 取上清液，浓缩至干，残渣以50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心5 min (4 ℃，12 000 r·min-1)，取上清液进样分析.

1.2.4应用

SPF级雄性ICR小鼠50只，体重(20±2) g，均由中国医科大学实验动物部提供，标准饲料喂养，小鼠自由摄食及饮水，实验前适应性饲养1 w. 按照体重随机分为5组，每组10只. 第1组为对照组，灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液；第2组为雄黄对照组，灌胃给予雄黄1.35 g/kg；第3组为甘草次酸对照组，灌胃给予甘草次酸48 mg/kg；第4组为甘草次酸干预低剂量组灌胃给予甘草次酸(16 mg/kg)+雄黄(1.35 g/kg)；第5组为甘草次酸干预高剂量组灌胃给予甘草次酸(48 mg/kg)+雄黄(1.35 g/kg). 每日灌胃1次，连续8 w. 每隔3 d称量体重1次，调节灌胃容量. 于末次给药24 h后，无水乙醚麻醉，冰浴取小鼠肾脏组织，用冷0.9%生理盐水冲洗干净，待用.

1.3方法学考察

1.3.1专属性

取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，除不加内标物质，按“1.2.3”项下依法操作；将一定浓度的甘草次酸和内标溶液加入混合肾组织匀浆液中，依同法操作；取雄黄对照组、甘草次酸对照组、甘草次酸联合用药低剂量组和联合用药高剂量组大鼠肾组织样品，依同法操作，进样10 μL，得色谱图.

1.3.2线性范围和标准曲线

取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，分别加入甘草次酸系列对照品溶液和内标溶液各200 μL，得浓度为9.600、19.20、48.00、96.00、192.0、960.0 μg/L的甘草次酸肾组织样品，按“1.2.3”项操作处理，制备标准曲线. 以甘草次酸和内标物色谱峰面积比值为纵坐标，以甘草次酸浓度为横坐标，采用加权最小二乘法线性回归，求得回归方程.

1.3.3精密度和准确度

按“1.3.2”项下操作，制备甘草次酸低、中、高三个浓度(50.00、250.0、800.0 μg/L)的质量控制(QC)样品，每一浓度样本平行制备5份，重复三个分析批，连续测定3 d，并与标准曲线同批测定，以当日的标准曲线计算QC样品的测定浓度，与配制的浓度对照，求得精密度和准确度.

1.3.4提取回收率

取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，按“1.3.2”项下操作，制备甘草次酸低、中、高三个浓度(50、250、800 μg/L)的QC样品，每一浓度样本平行制备5份；另取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，除不加系列标准溶液和内标外，按“1.3.2”项下操作，向获得的残渣中加入内标溶液和相应浓度的标准系列溶液各200 μL，涡旋混合，浓缩至干，残渣用50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液进样分析，获得峰面积，以每一浓度两种处理方法的峰面积比计算甘草次酸和内标的提取回收率.

1.3.5样品稳定性

取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，按“1.3.2”项下操作，制备甘草次酸低、中、高三个浓度(50、250、800 μg/L)的QC样品，每一浓度样本平行制备5份，分别考察样品经3次冷冻-解冻循环后(-20到20 ℃)、室温放置24 h及-20 ℃储存30 d的稳定性.

1.3.6基质效应

取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，除不加系列标准溶液和内标外，按“1.3.2”项下操作，向获得的残渣中加入内标溶液和相应浓度的标准系列溶液各200 μL，涡旋混合，浓缩至干，残渣用50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液进样分析. 另精密吸取低、中、高三个浓度的甘草次酸对照品溶液200 μL，加入内标溶液200 μL浓缩至干，残渣用50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液进样分析，以每一浓度两种处理方法的峰面积比计算甘草次酸和内标的基质效应.

1.4统计分析

所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P< 0.05作为检验的显著性差异.

2结果与讨论

2.1LC-MS/MS条件优化

近年来，采用LC-MS测定甘草次酸含量的研究报道多采用一级质谱扫描方式进行测定[4]，这种扫描方式无法减小因生物基质效应给测定结果造成的干扰. 本研究采用电喷雾离子源，负离子扫描模式，扫描方式为多反应检测对肾脏中甘草次酸的含量进行测定. 在保证提高检测灵敏度、准确度的同时，可有效的减小生物基质效应给测定结果造成的干扰. 本研究对二级质谱扫描进行了优化，结果表明，甘草次酸m/z为469.4→425.4，原儿茶酸为153.1→109.1. 毛细管电压3 500 V，离子源温度330 ℃，甘草次酸和原儿茶酸的毛细管出口电压分别为200 V和100 V，碰撞电压(CE)分别为38 V和15 V；保护气流量10 L/min. 并对色谱条件进行了优化，结果表明，流动相为乙腈-水(体积比80∶20)，流速为1 mL/min，进样量10 μL.

2.2内标物的选择及方法的专属性

采用内标法测定甘草次酸含量时，有研究报道熊果酸、格列喹酮、泼尼松龙作为内标物质[4-6]. 根据内标物质的选择原则，本实验选择原儿茶酸、齐墩果酸、没食子酸为内标物进行比较，原儿茶酸的化学结构与甘草次酸类似，能完全溶解于待测组织匀浆液中，不与甘草次酸发生化学作用，并与甘草次酸色谱峰完全分离，甘草次酸和原儿茶酸的保留时间分别为3.265和0.897 min(见图1)，且甘草次酸m/z为469.4→425.4，原儿茶酸为153.1→109.1. 所选3种内标物中原儿茶酸响应最高，稳定性最好，所以选用原儿茶酸作为内标物. 目前，有关选用原儿茶酸作为甘草次酸含量测定的研究未见报道.

在分析复杂的生物组织样品时，生物基质效应对测量结果的影响不容忽视. 由图1可见，小鼠肾脏组织中其他内源性物质不干扰甘草次酸和原儿茶酸的测定. 结果表明，该方法具有良好的专属性.

2.3标准曲线、精密度、准确度、回收率、稳定性及基质效应

在优化的实验条件下，利用建立的LC-MS/MS联用系统进行分析. 甘草次酸回归方程为Y=0.123 03X+1.036 7(r=0.998 9)，结果表明，在9.600～960.0 μg/L范围内线性关系良好.

精密度、准确度、回收率、稳定性与基质效应见表1. 实验证明，日内及日间精密度、准确度和回收率较好，并且基质效应不会对甘草次酸的含量测定结果造成影响.

此外，对样品的稳定性进行了考察，结果在室温条件下稳定24 h，-20 ℃冰冻条件下稳定30 d，反复冻融3次均不影响样品中甘草次酸的含量.

表1　甘草次酸的精密度、准确度、回收率及基质效应考察结果

2.4应用及讨论

结果表明，甘草次酸对照组、甘草次酸联合用药低剂量组、甘草次酸联合用药高剂量组中甘草次酸的含量分别为(4 992.6±719.7) ng/g、(337.18±119.16) ng/g和(862.70±251.96) ng/g，对照组和雄黄组未检出甘草次酸. 甘草次酸高剂量组、甘草次酸对照组与甘草次酸低剂量组比较有统计学意义(P< 0.05).

雄黄是含砷矿物药，雄黄及其制剂中含有大量砷[7-8]，在给予雄黄的大鼠血、脑及肾脏中均检测到砷[9-11]，而长期服用含雄黄制剂易引起药源性慢性砷中毒，造成肾脏损害[12-15]. 临床上，雄黄常与甘草配伍使用. 甘草为国老药，具有调和诸要的作用，对雄黄的毒性也有一定的解毒作用[16]. 本研究结果表明，甘草次酸干预后，肾脏中甘草次酸含量明显降低，可能与甘草次酸对雄黄的解毒作用有关，具体机制有待于进一步探讨.

3结论

以原儿茶酸为内标物质，采用二级质谱扫描的方法建立了LC-MS/MS测定肾脏中甘草次酸含量的方法，该法具有较高的专属性、灵敏度、精密度、准确度和回收率，可用于甘草与雄黄配伍机制的研究.

参考文献：

[1] TAIRA Z, YABE K, HANMAGUCHI Y, et al. Effects of Sho-saiko-to extract and its components, baicalin, baicalein, glycyrrhizin and glycyrrhetic acid,on pharmacokinetic behavior of salicylamide in carbon tetrachloride intoxicated rats [J]. Food Chem Toxicol, 2004, 42(5)：803-807.

[2] JEONG H G, YOU H J, PARK S J, et al. Hepatoprotective effects of 18 beta-glycyrrhetinic acid on carbon tetrachloride-induced liver injury: inhibition of cytochrome P450 2E1 expression [J]. Pharmacol Res, 2002, 46(3): 221-227.

[3] 张明发, 金玉洁, 沈雅琴. 甘草酸保护脑损伤及改善记忆功能的药理作用研究进展[J]. 药物评价研究, 2013, 1(36): 59-63.

[4] 王兴蕊, 欧阳慧子, 窦婷, 等. LC-MS法测定大鼠血浆中甘草次酸及其药动学研究[J]. 天津中医药大学学报, 2014, 34(4): 229-232.

[5] 荆晶, 陈西敬, 任伟超, 等. LC-MS法测定人血浆中的甘草次酸[J]. 药物分析杂志, 2007, 27(5): 673-676.

[6] 张军, 陈玟, 居文政, 等. LC-MS/MS法测定人血浆中甘草次酸及其临床药代动力学研究[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(9): 1313-1316.

[7] 姜泓, 张颖花, 丁敬华, 等. HPLC-HG-AFS法测定雄黄中As(Ⅲ)的含量[J]. 化学研究, 2008, 19(4): 67-69.

[8] 张颖花, 霍韬光, 姜泓, 等. 高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法检测牛黄解毒片中的砷[J]. 化学研究, 2012, 23(4): 60-63.

[9] 霍韬光, 畅蓓, 李维凯, 等. 雄黄染毒后大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化[J]. 化学研究, 2012, 23(2): 87-90.

[10] 霍韬光, 杨卉蕾, 畅蓓, 等. 雄黄对大鼠脑组织能量代谢的影响[J]. 化学研究, 2012, 23(1): 53-55.

[11] 张颖花, 高咏, 霍韬光, 等. 利用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收光谱联用技术测定雄黄染毒大鼠血中砷的含量[J]. 化学研究, 2013, 24(3): 274-276.

[12] 苑洁, 霍韬光, 王艳蕾, 等. HG-FAAS法测定雄黄染毒小鼠肝及肾脏中的砷含量[J]. 化学研究, 2015, 26(1): 61-63.

[13] 陈默, 苑洁, 霍韬光, 等. HPLC测定雄黄染毒小鼠血浆及肝脏中活性硫的含量[J]. 化学研究, 2016, 27(1): 81-84.

[14] 梁爱华, 李春英, 王金华, 等. 雄黄的毒性研究[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(14): 1889-1894.

[15] 李国明, 刘新清, 张雪艳, 等. 雄黄对小鼠肾脏形态学的影响[J]. 河北医药, 2002, 24(1): 60-60.

[16] 董菊, 严晓鹰, 王明燕, 等. 牛黄解毒片配伍影响雄黄砷毒性的动物实验研究[J]. 时珍国医国药, 2014, 2(25): 317-319.

[责任编辑：吴文鹏]

收稿日期：2016-01-11.

基金项目：国家自然科学基金项目(81473417).

作者简介：封聪(1989-), 男, 硕士生, 研究方向为分析毒理学. *通讯联系人, E-mail: jianghong@mail.cmu.edu.cn.

中图分类号：R286.02

文献标志码：A

文章编号：1008-1011(2016)03-0318-05

Glycyrrhetinic acid content in kidney of mouse determined by LC-MS/MS

FENG Cong1, HUO Taoguang1, WANG Shouyun2, ZHANG Yinghua1,WU Hui1, JIANG Hong1*

(1.CollegeofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China;2.CollegeofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

Abstract:LC-MS/MS method was established for the determination of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse. Multiple reaction monitoring scanning mode was used for the quantification of glycyrrhetinic acid using protocatechuic acid as the internal standard. The method has the advantages of sensitive, accurate, rapid and a wide linear range. The method was successfully used for the quantification of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse treated combination with glycyrrhetinic acid and realgar.

Keywords:LC-MS/MS; glycyrrhetinic acid; protocatechuic acid; content determination