硫化氢对肠缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡的影响*

卢根林，　吴爱兵，　王宏宾

(1义乌市中心医院普通外一科， 浙江 义乌 322000； 2广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 523808； 3青海大学附属医院肝胆胰外科, 青海 西宁 810001)

硫化氢对肠缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡的影响*

卢根林1△，吴爱兵2，王宏宾3

(1义乌市中心医院普通外一科， 浙江 义乌 322000；2广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 523808；3青海大学附属医院肝胆胰外科, 青海 西宁 810001)

[摘要]目的： 探讨硫化氢(H2S)对大鼠缺血再灌注(I/R)损伤回肠上皮细胞线粒体形态和功能及凋亡的影响。方法：24只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组和I/R+NaHS组。建立大鼠肠I/R损伤模型。在灌注前10 min时经I/R+NaHS组大鼠尾静脉注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg-1·h-1输注直到再灌注2 h，实验结束后取回肠标本测定回肠上皮细胞形态和呼吸功能指标。敏感硫电极法测定血浆H2S含量。RT-PCR检测回肠组织Bcl-2和Bax mRNA表达，Western blot 检测总caspase-3、活化型caspase-3、细胞色素C(Cyt C)、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果: I/R组线粒体的面积、体积密度、最大直径、最小直径、等效直径以及活化型caspase-3、Cyt C和Bax表达均显著大于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。I/R组线粒体数量、周长、比表面、面积密度和粒子数密度、血浆H2S、R3、R4、RCR、P/O和Bcl-2表达均显著小于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。结论:硫化氢下调活化型caspase-3、Cyt C和Bax的蛋白水平，上调Bcl-2表达，对I/R损伤大鼠回肠上皮细胞线粒体形态和功能均有保护作用。

[关键词]缺血再灌注损伤； 硫化氢； 线粒体

线粒体是细胞呼吸和产能的主要场所。缺血、缺氧时线粒体首先受损,进而损害整个细胞的功能[1]。线粒体-细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)途径是介导细胞凋亡的内源性途径[2-3]。H2S由小肠组织胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)催化L-半胱氨酸生成，抑制小肠上皮细胞凋亡，对肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤大鼠小肠黏膜屏障和肝功能起保护作用[4-5]，但其作用机制尚未阐明。H2S是否对线粒体及内源性凋亡途径有保护作用，本课题加以研究，结果报告如下。

材料和方法

1动物、试剂、仪器

健康雄性Wistar大鼠，SPF级，6周龄，体质量200～250 g，由浙江大学医学院动物中心提供，动物合格证号为201001018。

NaHS购自Sigma；羊抗大鼠caspase-3、活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax多克隆抗体购自Santa Cruz；羊抗大鼠β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG、DAB显示剂、SDS-PAGE凝胶、转膜液、硝酸纤维膜和Bradford蛋白试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司；Bcl-2的上游引物序列为 5’-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3’，下游引物序列为 5’-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’，扩增片段为411 bp；Bax的上游引物序列为5’-ATTGGAGATGAACTGGACAAT-3’，下游引物序列为5’-CCACA AAGATGGTCACTGTC-3’，扩增片段为337 bp；β-actin的上游引物序列为5’-CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG-3’，下游引物序列为5’-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3’，扩增片段为378 bp。各基因引物由Invitrogen合成；TRIzol和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa。

电泳仪(Bio-Rad)，3066型水平台式记录仪敏感硫电极和PXS-270离子计购于上海雷磁仪器厂，图像分析软件(VILBER LOURMAT)。

2方法

2.1实验动物分组及肠缺血-再灌注损伤模型的建立按随机数字表法将24只雄性Wistar大鼠分为假手术(sham)组、I/R组和I/R+NaHS组，每组8只。腹腔注射20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉，经腹正中切口剖腹及游离肠系膜上动脉，钳夹I/R、I/R+NaHS组大鼠肠系膜上动脉60 min和再灌注120 min，建立大鼠肠缺血-再灌注损伤模型[4-5]。灌注前10 min经I/R+NaHS组大鼠尾静脉注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg-1·h-1输注直到再灌注2 h，向S、I/R组尾静脉注入相同体积的生理盐水，作用时间和持续时间均同I/R+NaHS组[4-5]。实验结束后处死大鼠，取回肠末端标本用于电子显微镜检测、线粒体制备。取血离心分离血浆，-20 ℃保存。

2.2血浆H2S浓度测定参照文献[6-7]采用敏感硫电极法完成H2S浓度测定。

2.3线粒体形态和功能检测参照文献[1-3]制备小肠上皮细胞线粒体。(1)在电子显微镜测量线粒体并进行图像分析:测量线粒体的面积、周长、最大直径和最小直径，并计算线粒体的体积密度、面积密度、等效直径、比表面和粒子数密度，均以像素(pi-xel，P)作为单位。(2)Clark电极法测线粒体呼吸功能:以10 mmol/L琥珀酸钠为底物，反应介质的配置参照文献[1]，pH 7.5，加人1.2 mg线粒体蛋白，反应体积1.6 mL，测定温度30 ℃，反应1 min后，加入400 nmol/L ADP，在3066型水平台式记录仪上记录线粒体的氧化还原反应曲线，测定呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)和P/O值，计算Ⅲ和IV呼吸耗氧速率(R3和R4)，即单位时间内单位线粒体蛋白的耗氧摩尔数(μmol·g-1·min-1)。

2.4RT-PCR检测回肠组织Bcl-2和Bax mRNA表达TRIzol一步法提取回肠黏膜总RNA，电泳见28S和18S条带，以2.5 μg总RNA为模板按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。再按PCR试剂盒说明书进行cDNA扩增。PCR条件为94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃(β-actin和Bax)/58 ℃(Bcl-2)30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃ 7 min。各取7 μL PCR产物和3.5 μL DNA marker上样，各目的基因扩增产物和内参照β-actin扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，图像分析软件进行目的基因电泳条带密度分析，以Bcl-2/β-actin和Bax/β-actin分别表示Bcl-2和Bax的mRNA表达。

2.5Western blot 检测活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax蛋白的表达取回肠组织冰冻标本0.5 g于RIPA裂解液中碾磨，以Bardford法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白行SDS聚丙酰胺凝胶，转膜(0.65 mA/ cm2)；预杂交室温3 h，加入I抗[按1∶1 000(caspase-3)、1∶500(cleaved caspase-3)、1∶1 500(Bcl-2、Bax)、1∶750(Cyt C)和1∶600(β-actin)比例稀释]，4 ℃过夜。漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的IgG II抗室温反应1.5 h，0.1% TBST洗膜，ECL发光压片显影。使用BandScan分析胶片灰度值，以cleaved caspase-3/总caspase-3以及Cyt C、Bcl-2、Bax/β-actin灰度比值表示相对表达量。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1回肠上皮细胞超微结构改变

Sham组回肠黏膜微绒毛无脱失，线粒体丰富，无肿胀。I/R组回肠黏膜微绒毛脱失，线粒体肿胀、空泡变性。I/R+NaHS组少许回肠黏膜微绒毛脱失，部分线粒体肿胀、空泡变性，见图1。

Figure 1.The ultrastructural changes of the ileum epithelial cells under electron microscope.

图1电镜下回肠上皮细胞超微结构变化

2血浆硫化氢浓度的变化

I/R组血浆H2S浓度显著小于I/R+NaHS和sham组(P<0.01),见表1。

3回肠上皮细胞线粒体形态和功能变化

I/R组线粒体的面积、体积密度、最大直径、最小直径和等效直径均显著大于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。I/R组线粒体数量、周长、比表面、面积密度和粒子数密度、R3、R4、RCR、P/O值均显著小于I/R+NaHS和sham组(P<0.01),见表1、2。

表1各组大鼠H2S以及回肠上皮细胞线粒体数量、面积、周长和直径的比较

Table 1.Comparison of plasma H2S and area, circumference, count and diameter of ileum epithelial cell mitochondria in rats (Mean±SD.n=8)

GroupH2S(μmol/L)CMArea(×103)C(×103)ΦmaxΦminΦeSham42.7±7.224.3±4.61.8±0.45.7±0.564.5±7.432.7±6.250.7±8.9I/R24.8±2.7**12.7±3.3**5.3±0.9**1.8±0.3**87.2±9.6**61.2±7.9**78.2±5.1**I/R+NaHS35.3±3.2**##18.2±5.2**##3.6±0.5**##3.2±0.7**##78.3±10.2**##45.4±5.5**##67.4±6.3**##

CM: count of mitochondria; C: circumference; Φmax: maximum diameter; Φmin: minimum diameter; Φe: equivalent diameter.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

表2各组大鼠回肠上皮细胞线粒体密度、比表面和呼吸功能的比较

Table 2.Comparison of density, specific surface area and respiratory function of ileum epithelial cell mitochondria in rats (Mean±SD.n=8)

GroupVD(×10-1)AD(×10-2)PD(×10-5)SSA(×10-2)RCRP/OR3(μmol·g-1·min-1)R4(μmol·g-1·min-1)Sham1.0±0.12.2±0.410.4±1.610.2±1.23.5±0.62.2±0.4157.1±20.482.7±7.1I/R2.4±0.5**0.9±0.1**3.7±0.9**6.2±0.8**2.5±0.4**1.2±0.2**102.5±17.3**47.9±6.4**I/R+NaHS1.7±0.4**##1.4±0.5**##6.9±0.8**##8.8±0.6**##3.2±0.3##2.1±0.5##124.5±19.2**##64.2±5.7**##

VD: volume density; AD: area density; PD: population density; SSA: specific surface area; RCR: respiratory control ratio.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

4回肠组织Bcl-2和Bax mRNA水平以及活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax的蛋白水平

I/R组Bax mRNA水平及总caspase-3、活化型caspase-3、Cyt C、Bax的蛋白水平高于I/R+NaHS和sham组，Bcl-2 mRNA和蛋白表达低于I/R+NaHS和sham组(P<0.01),见图2、3及表3。

Figure 2.Hydrogen sulfide up-regulated Bcl-2 mRNA and down-regulated Bax mRNA in ileum epithelial cells of rats. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

图2硫化氢下调大鼠回肠上皮细胞Bax mRNA并上调Bcl-2 mRNA的表达

Figure 3.Hydrogen sulfide up-regulated Bcl-2 protein and down-regulated cleaved caspase-3, Cyt C and Bax proteins in ileum epithelial cells of rats.

图3硫化氢下调大鼠回肠上皮细胞活化型caspase-3、Cyt C和Bax蛋白并上调Bcl-2蛋白的表达

讨论

线粒体为细胞能量代谢的重要细胞器，三羧酸循环、电子传递链和氧化磷酸化的部位分别位于基质内、内膜，两者紧密相连。线粒体的这种结构与其呼吸功能及能量合成功能密切相关。线粒体形态和功能的损伤是导致细胞发生凋亡或坏死及其它后继变化的主要原因[1-3]。线粒体体积大小用等效直径、面积以及体积密度表示，线粒体数量大小用粒子数和粒子密度表示，线粒体形态和功能用单位线粒体所具有的膜表面(比表面)、周长和面密度表示[1-2]。本研究发现I/R组回肠黏膜微绒毛脱失，线粒体肿胀、空泡变性。I/R组线粒体体积增大(面积、体积密度和等效直径大于sham组)，线粒体数量减少(线粒体数和粒子数密度小于sham组),周长、面积密度、比表面、RCR、P/O、R3和R4减小，提示缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞线粒体形态和功能异常。细胞凋亡途径分外源性(死亡受体)、内源性(线粒体)和内质网凋亡3个途径。Bcl-2家族中抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因bax，分别编码位于线粒体膜表面的Bcl-2和Bax蛋白，形成异源、同源性二聚体，是线粒体完整性的关键调节者。Bax表达上调时线粒体膜通透性改变，细胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子从线粒体释放到细胞质，凋亡小体形成，细胞凋亡；Bcl-2占优势时细胞存活[8-10]。Caspase是一组以天冬氨酸为底物的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡中发挥关键作用。Caspase-3为关键的凋亡执行分子，在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，其表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[11]。本研究发现与sham组比较，I/R组Bcl-2表达下调，Bax、Cyt C和活化型 caspase-3表达上调。因此线粒体-Cyt C途径(即内源性凋亡途径)的Bax、Cyt C、活化型caspase-3表达上调和Bcl-2表达下调是导致缺血再灌注大鼠回肠上皮细胞线粒体细胞形态和功能异常的机制之一。H2S由小肠组织CSE催化L-半胱氨酸生成，抑制小肠上皮细胞凋亡，对肠缺血再灌注损伤大鼠小肠黏膜屏障和肝功能起保护作用[4-5]。本研究发现电镜下I/R+NaHS组少许回肠黏膜微绒毛脱失，部分线粒体肿胀、空泡变性；I/R+NaHS组回肠上皮细胞线粒体形态和功能显著优于I/R组。因此H2S对缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞线粒体形态和功能起保护作用。

表3　各组大鼠回肠组织活化型caspase-3、Cyt C、Bcl-2和Bax表达的比较

**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

H2S下调活化型caspase-3和PARP的蛋白水平，减少小肠上皮细胞凋亡[4]。H2S通过抑制 STAT3信号转导通路，减少肝细胞凋亡[5]。本研究发现I/R+NaHS组Bcl-2表达量高于I/R组,Bax、Cyt C和活化型caspase-3表达量低于I/R组;H2S与活化型caspase-3、Cyt C和Bax呈负相关，与Bcl-2呈正相关。因此H2S通过上调Bcl-2表达，下调Bax、Cyt C和caspase-3表达，即抑制线粒体-Cyt C途径(内源性凋亡途径)，保护回肠上皮细胞线粒体形态和功能，减轻大鼠回肠缺血再灌注损伤。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Influence of hydrogen sulfide on ileal epithelial cell apoptosis in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Gen-lin1, WU Ai-bing2, WANG Hong-bin3

(1TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,YiwuCentralHospital,Yiwu322000,China;2OncologyCenter,TheHospitalAffiliatedtoGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang523808,China;3DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,TheHospitalAffiliatedtoQinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:lugenlin007@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the influence of hydrogen sulfide (H2S) on intestinal epithelial cell mitochondrial morphology and function and the expression of caspase-3, cleaved caspase-3, cytochrome C (Cyt C), Bcl-2 and Bax in rats with intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury. METHODS: Wistar rats (n=24) were randomly divided into 3 groups (8 in each group): sham group, I/R group and I/R+sodium hydrosulfide (NaHS) group. The animal model of intestinal I/R injury was established. The rats in I/R+NaHS group received NaHS (100 μmol/kg bolus +1 mg·kg-1·h-1infusion) 10 min prior to the onset of reperfusion, whereas the rats in I/R group and sham group received equal volume of normal sodium. Ileum epithelial mitochondrial morphology and function were measured. Plasma H2S was detected by sensitive sulfide electrode. The expression of Bcl-2 and Bax mRNA was studied by RT-PCR. The protein levels of caspase-3, cleaved caspase-3, cytochrome C (Cyt C), Bcl-2 and Bax were tested by Western blot.RESULTS: The area, volume density, maximum diameter, minimum diameter and equivalent diameter of mitochondria, and the expression of cleaved caspase-3， Cyt C and Bax in I/R group were significantly higher than those in I/R+NaHS and sham groups (P<0.01). The mitochondrial count, circumference, specific surface area, area density and population density, plasma H2S， respiratory control rate (RCR), the ratio of P/O, R3, R4, and the expression of Bcl-2 in I/R group were sharply lower than those in I/R+NaHS and sham groups (P<0.01). H2S was negatively correlated with caspase-3, cleaved caspase-3, Cyt C and Bax (P<0.01), and was positively correlated with Bcl-2 (P<0.01). CONCLUSION: H2S has a protective effect on mitochondrial morphology and function in rats with intestinal I/R injury by down-regulating cleaved caspase-3, Cyt C and Bax and up-regulating Bcl-2.

[KEY WORDS]Ischemia-reperfusion injury; Hydrogen sulfide; Mitochondria

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0124- 05

[收稿日期]2015- 09- 06[修回日期] 2015- 10- 29

*[基金项目]国家自然科学基金青年科学基金资助项目(No.81201672)；义乌市人才引进项目立项项目(No.2012-R-04)

通讯作者△Tel: 0570-7368680; E-mail: lugenlin007@163.com

[中图分类号]R656.7; R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.021