缩泉丸对膀胱过度活动症大鼠膀胱充盈期盆神经放电的影响*

赖焕玲，　陈鹏宇，　段晓瑾，　徐伟君，　雷玉婧，　郭　茜，　吴清和，　黄　萍，　操红缨

(广州中医药大学，广东 广州 510006)

缩泉丸对膀胱过度活动症大鼠膀胱充盈期盆神经放电的影响*

赖焕玲，陈鹏宇，段晓瑾，徐伟君，雷玉婧，郭茜，吴清和，黄萍，操红缨△

(广州中医药大学，广东 广州 510006)

[摘要]目的： 研究缩泉丸对膀胱过度活动症(OAB)大鼠膀胱容量、压力及盆神经放电的影响，探讨缩泉丸对OAB大鼠膀胱感觉功能的作用。方法： SD雌性大鼠分别进行膀胱出口梗阻手术以复制OAB模型，随机分为OAB模型组、假手术组和缩泉丸高、中、低剂量组，给药4周后，以尿动力仪观察灌注过程中膀胱容量、压力及非排尿性收缩的变化，以多通道生理记录仪检测灌注过程中盆神经放电的变化。结果： OAB大鼠盆神经放电模式表现为放电频率先于压力达到峰值，而后压力达到峰值时，放电频率趋于平台或下降。OAB模型大鼠膀胱充盈过程中盆神经放电频率明显增强，膀胱压力上升，容量增加，非排尿性收缩增多；缩泉丸的干预能降低盆神经的放电冲动，减少神经放电增强引起的逼尿肌非排尿性收缩，降低膀胱压力，并呈剂量依赖性。结论： 缩泉丸对OAB大鼠膀胱感觉功能的调节可能是其治疗OAB的机制之一。

[关键词]缩泉丸； 膀胱过度活动症； 膀胱出口梗阻； 盆神经放电

国际尿控协会(International Continence Society，ICS)把膀胱过度活动症(overactive bladder，OAB)定义为以尿急为主要表现，伴或不伴急迫性尿失禁的一种症候群，常伴有尿频和夜尿增多[1]。膀胱过度活动症是一种常见的膀胱功能障碍，虽无生命危害，但严重影响患者的生活质量。以往对于OAB的发病机制存在3种主流的假说[2]：肌源性假说指产生不随意逼尿肌收缩的必要条件是平滑肌的改变；神经源性假说指由于脑部或脊髓中枢抑制通路或者膀胱外周神经传入末梢敏感性受到损害，使得原始排尿反射无法得到抑制，促使逼尿肌过度活动；膀胱的自主性假说认为任何能够引起逼尿肌模块间联系增强的因素均易导致膀胱逼尿肌过度活动。研究发现，机械刺激或化学物质刺激引起膀胱传入神经敏感性增强导致排尿反射亢进引起自主或不自主排尿，使得膀胱感觉功能成为另一个OAB的发病机制的研究热点。正常的膀胱感觉功能实际上就是大脑皮层对来自下尿路传入神经冲动的主观感知[3]，是维持人体周期性储尿与排尿的重要前提之一。神经传导亢进会导致尿频、尿急、尿痛和急迫性尿失禁等储尿期症状[4]。

中医以补肾缩尿为主要原则治疗OAB相关症状，在临床证实是一种行之有效的治疗方法。缩泉丸(Suoquan Wan，SQW)是中医传统古方，由益智仁、乌药和山药组成，具有温肾祛寒，缩尿止遗的功效，众多临床研究也表明以缩泉丸为代表的中医补肾缩尿治疗法在膀胱过度活动症的临床治疗中取得了广泛而可靠的疗效，但缩泉丸干预膀胱过度活动症的具体作用机制尚未十分明确。我们在前期研究中发现，缩泉丸可以改善多尿[5]、调节下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴[6]；并能通过下调M3R及其介导的信号转导通路和上调β3-AR及其介导的信号转导通路[7-9]，从肌源性和神经源性两个角度共同恢复逼尿肌舒缩功能。鉴于缩泉丸在临床治疗尿频、遗尿、尿失禁等的显著疗效，本实验以期通过观察缩泉丸对OAB大鼠膀胱盆神经放电的影响，完善缩泉丸治疗OAB的作用机制。

材料和方法

1动物、主要药品与仪器

SPF级雌性SD大鼠，200～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号为SYXK(粤)2013-0020，合格证号为440005900000322；饲养条件采用12 h昼夜交替照明，湿度50%～70%，温度(24±2)℃。动物实验设施许可证号为SYXK(粤)2013-0085，使用证明号为00058727。缩泉丸胶囊为湖南汉森制药有限公司产品；乌拉坦为国药集团化学试剂有限公司产品；氯化钠(NaCl)为天津市大茂化学试剂厂产品；BL-420E 型多通道生理信号采集处理系统及电极(成都泰盟科技仪器有限公司)；WZ-50C6型微量注射泵(浙江史密斯医学仪器有限公司)；Laborie UDS-94型尿动力学检查仪(Laborie)；测压导管为压力感受器连接3F硬膜外麻醉导管。

2方法

2.1OAB模型大鼠的建立——膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction)手术SPF级雌性大鼠，体重220～240 g，采用近端尿道(膀胱颈)结扎法建立OAB模型。实验方法：1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，将直径为1 mm的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱，以此作为尿道支撑。取下腹部正中切口，切开皮肤及皮下组织，找到膀胱。膀胱颈近端尿道稍作分离，于此处穿过2-0丝线，结扎膀胱颈，结扎丝线的松紧标准以牵拉探子时周围组织可随之移动，而探子又可轻易拔除为度，然后拔除探子，逐层缝合关闭切口，适量使用抗生素。假手术组动物按照上述手术方法行开腹及近端尿道钝性分离，但不行结扎梗阻实验，作为对照。

2.2实验分组及给药将动物分为5组(每组10只)：假手术组、模型组和缩泉丸高、中、低剂量组。根据动物公斤体重剂量折算系数法，缩泉丸以临床的10、5和2.5倍换算出1 170、585和293 mg·kg-1·d-13个给药组的剂量，缩泉丸胶囊除去胶囊壳，将所含药物粉末以蒸馏水配制成高、中、低3种浓度的药液，温水浸泡20 min，超声10 min后使用，每次灌胃前振荡混匀；假手术组和模型组给予同体积蒸馏水。手术3 d后进行给药，持续4周。

2.3分离盆神经末次给药后，参考文献方法分离盆神经[10]：大鼠以25%乌拉坦(1.0 g/kg)全麻后，打开腹腔，暴露后腹膜和盆腔腹膜，沿盆神经节向中枢端分离盆神经。将肠道及一侧子宫轻推至另一侧后，可在髂血管分叉下方和膀胱后方形成一个类似三角形的凹陷空间，滴加 37 ℃温石油浸泡盆神经，保温防干，同时便于将盆神经悬挂于电极而不与周围组织接触。分离好的大鼠盆神经悬挂于双钩铂丝电极，参考电极连接于皮肤。通过加热垫将大鼠肛温控制于37 ℃ 左右。

2.4膀胱容量、压力及盆神经放电的记录膀胱顶造瘘及测压管连接：于膀胱顶切开一小口，插入3F导管，2-0丝线结扎。此过程中注意切勿夹持膀胱以免对膀胱壁造成损伤。导管连接T型转换接头，3F导管通过T型转换接头连接膀胱测压管和灌注管，测压管连接尿动力仪压力传感器，灌注管连接微量灌注泵。打开BL-420E型多通道生理信号采集处理系统，设置好实验模式及测量参数如下：模式为生物电，采样频率10 kHz，扫描速度2.0 s/div，灵敏度20 μV，时间常数0.001 s，高频滤波3 kHz，陷波50 kHz。连接电极，用螺旋调节器调整记录电极与盆神经的接触位置，观察盆神经放电波形，以信噪比高、基线稳定、干扰少为效果佳。记录盆神经传入放电前，用眼科弯镊夹断盆神经中枢端，减少中枢端传入电活动的影响[1]。

2.5盆神经的定位及功能确认和参数记录对膀胱进行缓慢灌注(30 μL/min)充盈，可诱发盆神经传入放电频率进行性增强，表明盆神经无明显损伤，放电活动正常。而后排空膀胱，待盆神经自发传入放电恢复至基线水平，再按100 μL/min速度进行灌注(每次灌注前需待神经放电恢复至基线水平)。

体内置零，灌注前记录盆神经自发传入放电基线开启微量注射泵向膀胱内灌注生理盐水，此过程中注意观察尿道外口有无液体溢出。液体溢出时记录的膀胱压即为膀胱漏尿点压(bladder leak point pressure，BLPP)；同时停止灌注，观察膀胱压力曲线，记录其峰值，即为最大膀胱排尿压(maximum voiding pressure，MVP)；记录灌注过程中非排尿性收缩次数(non-vioding contraction，NVC)；记录此过程中膀胱神经传入电活动，即盆神经放电，包括基线值及最大放电频率(maximum firing frequency)，直至排尿过程完成后停止。计算膀胱最大容量(maximum bladder capacity，MBC),公式为：MBC=灌注时间×灌注速度。

2.6放电频率分析用BL-420E多通道生理信号采集处理系统，基线记录60 s 内的平均放电频率作为基线值，充盈过程中放电频率最大值(10 s内平均值)减去基线值作为平均放电频率(mean firing frequency,MFF)，以1∶1信噪比行阈值分析。

3统计学处理

计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0统计学软件进行完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)和非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1缩泉丸对大鼠膀胱充盈期盆神经传入电活动的影响

以生理盐水充盈膀胱，与假手术组相比，OAB模型大鼠盆神经放电明显增强；与模型组相比，缩泉丸高剂量组神经放电明显减少，中、低剂量组有所减少，但差异未见统计学意义，见图1。

Figure 1.The effect of SQW on pelvic nerve firing in OAB model rats. Mean±SD.n=8～10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsOAB group.

图1缩泉丸对大鼠在膀胱充盈期盆神经传入电活动的影响

2假手术组与模型组灌注过程中盆神经放电及膀胱压力图的变化

本实验采用BL-420E生理仪记录膀胱充盈过程中的盆神经放电变化，同时使用尿动力学检测仪同步检测膀胱压力变化。实验结果示例图见图2、3。盆神经放电模式为膀胱充盈期间，在膀胱压力急剧上升之前，传入神经放电持续而缓慢；当膀胱压力达到排尿阈值，盆神经放电的频率及幅度均先于膀胱压力达峰，致使膀胱排尿。OAB模型大鼠盆神经放电-膀胱压力检测结果与假手术大鼠的检测结果比较，OAB大鼠充盈期间神经冲动发生频率增加，而由于梗阻导致膀胱功能受损，逼尿肌不稳定收缩频率上升但未达到排尿所需的压力；排尿发生后，神经放电下降但仍有小幅度的冲动发生，推测由于残余尿量的刺激，导致放电的增加使得逼尿肌收缩以期排除残余尿，但由于排尿后膀胱能量损耗，收缩压力不足，残余尿量未能排尽。此循环导致排尿间隔缩短，下一排尿周期提前，若不及时解除梗阻进行治疗，膀胱功能及盆神经感觉功能均会受到严重损伤。

Figure 2.Pelvic nerve firing during bladder intravesical instillation in sham group.

图2假手术组大鼠膀胱充盈过程中神经放电示例图

Figure 3.Pelvic nerve firing during bladder intravesical instillation in OAB group.

图3OAB模型组大鼠膀胱充盈过程中神经放电示例图

3缩泉丸对大鼠膀胱充盈期膀胱压力、容量及非排尿收缩的影响

与假手术组相比，OAB模型大鼠BLPP和MVP明显升高，MBC明显增大，NVC明显增多；与模型组相比，缩泉丸各剂量组BLPP和MVP明显下降，MBC明显减少，高、中剂量组NVC明显减少,见表1。

表1　缩泉丸对大鼠在膀胱充盈期膀胱压力、容量及非排尿性收缩的影响

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsOAB.

讨论

膀胱由复杂且分布广泛的神经支配。交感神经和副交感神经传出纤维分别通过下腹神经和盆腔内脏神经传至膀胱和尿道。根据膀胱不同组织结构对机械刺激的反应，盆神经可以区分为支配肌层、支配尿路上皮、支配肌层及上皮层、支配浆膜层共4支。已有研究显示，参与膀胱机械感觉功能的传入神经主要是腰部内脏神经(lumbar splanchnic，LSN)及盆神经(pelvic nerve, PN)。而研究区分出4类型的传入神经纤维中有3类在2种神经通路中均表达，并参与调节排尿反射。在膀胱充盈过程中，可能存在3 种明显的感觉[11]：充盈初感、初排尿欲、强烈排尿欲。与排尿欲相关的冲动走行于盆神经内，排尿欲望来自于膀胱壁的牵张。膀胱的机械敏感性所表现出的静态和动态的变化以及在绝对水平上对尿液形成的反应依赖于逼尿肌在低速膨胀过程中的适应性变化。膀胱膨胀(充盈)速度可以严重影响膀胱测压的测定结果[12]。Shea 等[13]的研究也曾采用生理盐水以100 μL/min的速度模拟生理性充盈进行大鼠膀胱灌注。本研究通过预实验并参考国外相关研究确定了灌注的方法及速度，采用造瘘法，以100 μL/min的速度进行灌注[10]，以期减少由于灌注速度对膀胱壁带来的刺激而影响实验结果的真实性。模型动物出现膀胱压力、容量增大，储尿期膀胱不稳定收缩明显增加，且神经放电增强，说明模型已经形成。

电生理学实验在猫和大鼠身上发现了神经传入电活动对正常膀胱功能的重要性。在正常情况下，膀胱传入电活动主要受细小的有髓鞘的Aδ 纤维的调节。这些传入纤维通过髓鞘到达脑干周围神经灰质，此处正是感受膀胱充盈与否的中枢区，调节着排尿反射。另一种传入神经纤维——无髓鞘的C纤维，在正常情况下，大多数的C纤维并不活跃，但大多数的C纤维可被化学物质激活，导致膀胱收缩等反应[14]。Birder 等[15]采用动物在麻醉状态下进行实验，显示出C 纤维对造瘘膀胱膨胀无明显的反应，但认为感觉传入电活动的小幅度降低可能是由C 纤维引起的，其机制尚未明确。

本实验采用多通道生理记录仪研究OAB及缩泉丸干预后的大鼠在麻醉情况下的盆神经放电信号变化，实验结果显示，膀胱对机械牵张的反应主要表现为随着灌注的进行，膀胱感受到膨胀牵张，起初神经放电随着膀胱压力的增大仅有小幅度增加，在膀胱压力急剧上升之前，传入神经放电的增加都显得持续而缓慢。当膀胱压力达到排尿阈值，盆神经放电的频率及幅度均大幅度增加，致使膀胱排尿。该结果与目前的研究相类似[16-17]。即放电频率先于压力达到峰值，而后压力达到峰值时，放电频率趋于平台或下降；OAB模型大鼠膀胱充盈过程中盆神经放电频率明显增强，提示神经反射亢进，可导致非排尿性收缩增加，膀胱压力增大，该结果与目前国内外研究结果相似。缩泉丸的干预能明显降低盆神经的放电冲动，减少神经放电增强引起的逼尿肌不稳定收缩及排尿压力，并能减少膀胱容量，利于尿液及时排出，其作用呈剂量依赖性。上述结果揭示缩泉丸对盆神经放电的调节，对膀胱感觉功能的作用可能是其治疗OAB的作用机制之一。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of Suoquan Wan on bladder pelvic nerve firing during intravesical instillation of OAB rats

LAI Huan-ling, CHEN Peng-yu, DUAN Xiao-jin, XU Wei-jun, LEI Yu-jing, GUO Qian, WU Qing-he, HUANG Ping, CAO Hong-ying

(GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China.E-mail:hongyingcao@yahoo.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of Suoquan Wan (SQW) on bladder volume, pressure and pelvic nerve firing in overactive bladder (OAB) rats. METHODS: The OAB rat model was established by bladder outlet obstruction, and the rats in sham group received sham surgery. The OAB rats were randomly divided into OAB model group, high-dose SQW group, middle-dose SQW group and low-dose SQW group. After 4 weeks of treatment, an aerodynamic instrument was used to measure the pressure, volume and non-voiding contraction of all the rats. The pelvic nerve firing signal was recorded by the BL-420E multichannel recorder. RESULTS: The frequency of pelvic nerve firing increased to the peak before pressure. When the pressure reached the peak value, the firing signal remainded or reduced. The firing, pressure, volume and non-voiding contraction in the OAB model rats were significantly increased compared with the sham rats. After treated with SQW, the firing and pressure was dose-dependently decreased. CONCLUSION: The regulatory effect of SQW on the pelvic nerve may be one of the mechanisms for treating OAB.

[KEY WORDS]Suoquan Wan; Overactive bladder; Bladder outlet obstruction; Pelvic nerve firing

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0151- 05

[收稿日期]2015- 06- 15[修回日期] 2015- 08- 28

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81202982)

通讯作者△Tel： 020-39358086; E-mail: hongyingcao@yahoo.com

[中图分类号]R363; R285.5

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.026