沙田柚热激蛋白HSP90基因的鉴定分析

郭丹妮，刘玉洁，韩 愈，覃信梅，李惠敏，秦新民

（广西师范大学生命科学学院，珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西桂林541004）

沙田柚热激蛋白HSP90基因的鉴定分析

郭丹妮，刘玉洁，韩 愈，覃信梅，李惠敏，秦新民＊

（广西师范大学生命科学学院，珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西桂林541004）

为探明沙田柚自交不亲和分子机理，以沙田柚（Citrus grandis var.Shatianyu Hort）自交和异交花柱为材料，对其进行转录组测序；通过差异分析获得相关基因，并研究其理化性质。结果表明：获得的Hsp90基因全长2 602bp（GenBank登录号：KU517851），开放阅读框（ORF）全长为2 100bp，编码699个氨基酸，编码的蛋白质分子量为80.55KDa，理论等电点为5.01，含有1个与HSP90超家族（HSP90superfamily）相同的保守结构域。沙田柚Hsp90蛋白氨基酸的同源性与甜橙（XM＿006490568）、克莱门柚（XM＿006421973）亲缘关系较近，同源性高达99%，属同一进化分支。

沙田柚；Hsp90基因；理化性质

热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）在生物细胞热应激反应中有重要作用，广泛存在于动物、植物细胞以及真菌中，在高温胁迫环境下，热激蛋白合成显著增加［1］。根据分子量大小Hsps可分为Hsp60、Hsp70、Hsp80、Hsp90、Hsp110及smHsp（小分子量Hsp）6个家族［2］。其中，HSP90家族蛋白高度保守，参与组装、成熟、稳定及激活各种关键的信号蛋白，如激素受体、蛋白激酶和转录因子等［3］。Hs90包括3个结构域：N端结构域（ND）、中间结构域（MD）和C端二聚体功能结构域（CD）［4］。Hsp90参与细胞骨架动力学、细胞形态以及机动性的调控。Hsp90通过一种依赖ATP的机制调控肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。无细胞系统的试验证明，利用ATP能使Hsp90从F－肌动蛋白上解离，细胞中Hsp90表达水平升高使细胞形态发生改变和增加细胞迁移能力。

自交不亲和在雌雄同株植物中比较常见，是显花植物防止自交授粉最有效的遗传机制［5］。许多研究结果表明，植物配子体自交不亲和的关键因子为S基因。但近年研究发现，一些胁迫诱导基因、转录因子、钙离子和激素信号相关的基因也可能参与了植物的自交不亲和反应。如在罂粟属的自交不亲和（self－incompatibility，SI）反应中，胞质中游离的钙离子浓度增加，为适应这种变化，肌动蛋白发生重排导致肌动蛋白大量解聚，从而使花粉管尖端生长受到抑制。雌蕊对花粉进行识别的信号分子是由S位点连锁基因编码的糖蛋白，两者相互识别的过程实际是雌蕊信号分子与花粉信号分子识别及信号传递过程［6］。目前已发现，肌动蛋白细胞骨架是SI信号的靶位点［7］，在触发SI反应后4～12h发生细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的典型特征，即核DNA发生断裂。Thomas等［8］研究罂粟属SI过程发现，肌动蛋白的解聚启动了下游PCD信号的传递过程。Poulter等［9］也证明，在SI诱导的PCD上游需要微丝和微管的信号整合。因此，罂粟花粉SI反应触发PCD，从而使花粉管发生不可逆性的停止生长［10］。

此外，在体外环境中，日本梨S－RNase诱导线粒体发生改变，如膜电位崩溃、细胞色素C渗漏和膜膨胀，破坏顶端极性生长必须的tip－localized活性氧种类（reactive oxygen species，ROS），肌动蛋白细胞骨架发生解聚，降解不亲和花粉管的核DNA。说明，PCD特异性发生在不亲和花粉管中［1113］。Poulter等［14］通过对罂粟属自交不亲和诱发的细胞骨架蛋白质变化进行研究发现，在SI样品与亲和样品中，热激蛋白和分子伴侣在SI中表达量更高，有5个热激蛋白／分子伴侣蛋白在SI样品中特异性表达，说明这些热激蛋白可能在自交不亲和中发挥作用，已证实这些蛋白属于热激蛋白Hsp90家族成员［15］。

沙田柚属于配子体高度自交不亲和的芸香科柑橘属果树。目前，已知沙田柚属于配子体自交不亲和，花柱1／2左右为花粉管生长抑制部位［16］，花柱和花粉管中自交不亲和特异蛋白得到分离和鉴定［1718］。为了进一步探讨沙田柚自交不亲和的机理，笔者对自交和异交花柱进行转录组测序，对沙田柚热激蛋白Hsp90基因序列进行功能预测，分析该基因编码的蛋白质生物化学特征，旨在为深入研究沙田柚自交不亲和分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采自广西省灵川县潮田乡大山口村10年树龄的沙田柚树。在果树开花期间，对当天开花的花朵进行人工异交授粉（去除沙田柚雄蕊，以酸柚花粉授粉）和自交（沙田柚花粉授粉）授粉，分别收集自交和异交1～3d的授粉花柱以及当天未开花的花柱，切取1／2上部花柱，液氮速冻后，转入－80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 总RNA的提取和测序

对总RNA提取是采用改良的Trizol法［19］，检测合格的RNA交由深圳华大基因科技服务有限公司进行建库和测序。建库和测序的程序和方法见参照文献［20］的方法进行。

1.3 序列分析和同源性分析

利用生物信息学软件DNAMan以及NCBI上ORF Finder分析序列，Conserved Domain Architecture Retrieval Tool分析该基因编码的氨基酸；运用在线软件（http：／／web.expasy.org／protparam／）和跨膜数据库TMbase（http：／／ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html）分析Hsp90蛋白质的亲疏水性以及是否存在跨膜结构；利用DNAMan软件分析蛋白质疏水性。在线蛋白磷酸化位点分析软件NetPhos 2.0Server预测该蛋白可能的磷酸化位点，运用在线分析软件Predict Protein（http：／／www.predictprotein.org／）分析Hsp90蛋白的二级结构，在线软件SWISS－MODEL预测Hsp90蛋白三级结构；用DNAman软件对基于氨基酸序列Hsp90基因进行构树。

2 结果与分析

2.1 基因的生物信息学性质

沙田柚热激蛋白（CL6153.Contig3＿All）基因组序列全长为2 602bp（GenBank登录号为KU517851），该序列的开放阅读框为2 100bp，编码699个氨基酸（图1）。

图1 Hsp90蛋白基因序列和预测氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of Hsp90protein gene and the deduced amino sequence

图2 Hsp90蛋白的保守结构域Fig.2 Conserved domains of porcine Hsp90protein

2.2 功能结构域

由图2可见，该蛋白质含有1个与Hsp90超家族（Hsp90superfamily）相同的保守结构域，同时该基因的N－端具有ATPase结合位点。

2.3 编码蛋白质的亲水性和跨膜区域

该基因编码的蛋白质分子量为80.55KDa，等电点pI为5.01，分子式为C3565H5677N933O1130S27，不稳定系数为41.78，属于不稳定蛋白。其中，该蛋白质携带的负电荷氨基酸（Asp＋Glu）总数为140，正电荷氨基酸（Arg＋Lys）总数为109。由图3可见，该蛋白质编码的肽链中疏水性最大值为3.26，最小值为－3.76，初步鉴定该蛋白质为亲水蛋白。该蛋白存在2个跨膜螺旋，属于跨膜蛋白。

图3 沙田柚Hsp90蛋白的跨膜区预测Fig.3 Result of TMpred prediction on Hsp90protein of C.grandis var.Shatinyu

2.4 蛋白质的磷酸化

对Hsp90蛋白进行预测，该多肽链中分值≥0.5可能的磷酸化位点共有34个。其中丝氨酸（Ser）共有28个，分别位于肽链28位、57位、102位、118位、158位、166位、221位、257位、284位、303位、426位、440位、443位、444位、449位、471位、516位、541位、569位、597位、599位、600位、603位、604位、632位、651位、671位和695位。苏氨酸（Thr）共有9个，分别位于肽链的79位、140位、141位、215位、216位、278位、327位、441位和448位。酪氨酸（Tyr）共有10个，分别位于肽链的27位、149位、179位、209位、282位、407位、465位、489位、493位和601位。

2.5 蛋白质的二级及三级结构

由图4可知，沙田柚Hsp90蛋白中α－螺旋、β－折叠和其他结构比例分别为40.20%、13.16%和46.64%。该蛋白三级结构包括9个α－螺旋，4个β－折叠，由无规则卷曲连接。

图4 Hsp90蛋白的三级结构Fig.4 The tertiary structure of Hsp90protein

2.6 不同物种间Hsp90蛋白的同源性

11种植物的Hsp90蛋白氨基酸序列的比对结果表明，沙田柚Hsp90与甜橙（XM＿006490568）和克莱门柚（XM＿006421973）氨基酸序列同源性达99%，与其他植物的氨基酸序列同源性在87%以上（图5），说明植物体内HSP90的高度保守性。

图5 基于氨基酸序列的Hsp90蛋白系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Hsp90protein

3 结论与讨论

Hsp90蛋白的N端通常具有ATP结合区域，该区域高度保守，胞质中的Hsp90在C端具有MEEVD基序［21］。将动物、植物以及真菌的Hsp90序列进行比对后，Gupta［22］提出，Hsp90家族蛋白存在5条特征序列。本研究获得的CL6153.Contig3＿All编码的氨基酸序列具有5个特征序列，同时在N端具有1个ATP结合区域，该区域是Hsp90发挥分子伴侣功能时起到重要作用。经氨基酸序列比对发现，CL6153.Contig3＿All与甜橙和克莱门柚等植物的Hsp90蛋白具有较高的同源性，通过构建系统进化树发现，CL6153.Contig3＿All与同为芸香科的甜橙和克莱门柚位于同一进化分支，并与番茄、辣椒和茄子等植物形成一个大分支。因此，CL6153.Contig3＿All为植物Hsp90基因家族成员。

Hsp90蛋白在细胞受到外界胁迫时，在短时间内大量合成。除参与胁迫反应，Hsp90家族蛋白还参与细胞形态与机动性、细胞骨架动力学，并与微管蛋白以及肌动蛋白结合。肌动蛋白细胞骨架作为自交不亲和信号的靶位点，同时肌动蛋白解聚启动细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）下游位点［8］，并且PCD程序的启动使得花粉管生长停止和遭到不可逆的破坏［10］。总之，SI触发不亲和花粉的胁迫应答，其中牵涉到热激蛋白及分子伴侣，说明热激蛋白可能在自交不亲和反应中发挥作用［14］。本研究通过转录组测序获得的沙田柚Hsp90蛋白基因，关于其在沙田柚自交不亲和中作用还有待进一步研究。

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（责任编辑：刘忠丽）

Identification and Analysis of HSP90 Gene in Citrus grandis var.Shatianyu

GUO Danni，LIU Yujie，HAN Yu，QIN Xinmei，LI Huimin，QIN Xinmin＊
（College of Life Science，Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education，Guangxi Normal University，Guilin，Guangxi 541004，China）

The self－pollinated and cross－pollinated style of C.grandis var.Shatianyu were used as test materials and based on the successful transcriptome sequencing technology，the authors identified a Hsp90 gene to explore the molecular mechanism of self－incompatibility.Results：Hsp90gene was 2602bp （GenBank accession number：KU517851）in length with an open reading frame（ORF）of 2100bp，encoding 699amino acids with deduced molecular weight of 80.55KDa，and theoretical pI value of 5.01，and contained a HSP90superfamily conserved domain.The homology analysis indicated that the Hsp90 protein shared 99%homology with that of Citrus sinensis（XM＿006490568）and Citrus clementina（XM＿006421973）.Phylogenetic analysis revealed that Hsp90gene showed closer kinship with that of C.sinensis and C.clementina，indicating that they belong to the same evolutionary branch.

Citrus grandis var.Shatinyu；Hsp90gene；physicochemical property

S666.3

A

1001－3601（2016）08－0328－0011－04

2016－02－17；2016－07－12修回

国家自然科学基金项目“沙田柚配子体自交不亲和的分子机理研究”（31360477）；广西教育厅项目“沙田柚花柱不亲和机理研究”（2013YB036）

郭丹妮（1992－），女，在读硕士，研究方向：植物分子生物学。E－mail：15108002583＠163.com

＊通讯作者：秦新民（1956－），男，教授，博士，从事植物分子生物学研究。E－mail：xmqin＠mailbox.gxnu.edu.cn