羊耳菊种子生活力的最佳测定条件

成小璐，魏怡冰，魏升华，檀龙颜

（贵阳中医学院药学院，贵州贵阳550002）

羊耳菊种子生活力的最佳测定条件

成小璐，魏怡冰，魏升华＊，檀龙颜

（贵阳中医学院药学院，贵州贵阳550002）

为获得羊耳菊种子生活力的最佳测定条件，采用四唑染色法，以氯化三苯基四氮唑（TTC）浓度、染色温度和染色时间为指标，通过正交试验和响应面试验对测定条件进行优化。结果表明：TTC浓度1.5%、染色温度40℃、染色时间3h为羊耳菊种子生活力测定的最佳条件，3个检测指标对种子生活力测定的影响为染色温度＞染色时间＞TTC浓度。

羊耳菊；种子；生活力；TTC染色法

羊耳菊又名羊耳风（贵州）、山白芷等，为菊科（Compositae）旋覆花属（Inula）植物羊耳菊〔Inula cappa（Buch.Ham.）DC.〕的根或全草［1］。具有除风散寒、行气止呕、止咳定喘、止汗、止泻、止血、消肿解毒及利湿的功效［2］。羊耳菊分布于四川、云南、贵州、广西、广东、江西、福建及浙江等地［1］。近年来，对羊耳菊的研究主要涉及化学成分、药理学和生药学方面［3－10］。因为羊耳菊具有良好的抗菌和消炎等药用价值，所以多种中成药把羊耳菊作为主要的原料药，如莲菊感冒胶囊［11］、甘菊滴丸［12］、菊黄上清含片［13］及贵州百灵药业的双羊喉痹通颗粒等。尽管对羊耳菊化学成分和药理学等方面进行了诸多研究，但有关羊耳菊引种驯化和人工栽培方面鲜有报道。

随着市场需求量的增加，对羊耳菊的采挖力度逐年加大，但其野生资源有限，且目前各地尚未有人工种植。因此，对羊耳菊进行引种驯化研究十分必要［14］。而药用植物种子、种苗的生产是药材生产的基础，其质量是药材产量和品质形成的重要前提和基础［15］。种子质量对羊耳菊规模化和规范化种植起着关键性的作用，发芽率是检测种子质量的重要指标，但由于羊耳菊的发芽试验时间较长而不能快速得到结果。测定种子生活力可以快速确定种子发芽能力，是种子生产和贸易的重要技术［16－17］。因此，笔者等对羊耳菊种子发芽能力的最佳测定条件进行了试验，为客观评价羊耳菊种子的发芽能力，预测其播种量和出苗率提供理论依据，为其大田播种育苗提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

羊耳菊种子于2014年12月29日采自贵州省安顺市西秀区龙宫片区，经贵阳中医学院鉴定为羊耳菊的种子，于4℃冰箱保存备用，凭证标本保存于贵阳中医学院药学院标本馆。

试剂为氯化三苯基四氮唑（TTC）。

1.2 种子预处理

1）浸泡。将经观察到具胚、较饱满的种子除去冠毛，置于滤纸上，加入蒸馏水，加水量以刚没过种子为宜，待其吸胀后取出，用刀片切去种子靠近冠毛部位的1／4，置于直径10cm培养皿中，每个培养皿按10×10顺序放置100粒种子，供染色用。

2）染色。每个培养皿加入不同浓度的TTC溶液，分别置于不同温度的恒温培养箱中避光染色，达到时间后取出种子，用清水冲洗，将种子放在滤纸上，根据染色面积大小及程度判断种子生活力。另取100粒种子在沸水中煮10min后取出，染色，作为对照组。每个处理重复3次。

1.3 种子生活力测定适宜条件的试验

1.3.1 正交试验 以TTC浓度、染色温度和染色时间3个直接影响生活力测定结果的因素作为检测指标，每个因素设置3个水平（表1）。

表1 羊耳菊种子生活力测定条件正交试验的因素和水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

1.3.2 单因素试验

1）染色温度 取羊耳菊种子100粒，TTC浓度为0.5%，染色时间为1h，染色温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，测定种子生活力。

2）染色液浓度 取羊耳菊种子100粒，染色温度为35℃，染色时间为1h，TTC浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，测定种子生活力。

3）染色时间 取羊耳菊种子100粒，染色温度为35℃，TTC浓度为1.5%，染色时间分别为1h、2h、3h、4h及5h，测定种子生活力。

1.3.3 响应面优化试验 根据单因素试验结果，以染色温度度（x1）、TTC浓度（x2）、染色时间（x3）3个因素为变量，以种子染色率（y）为响应值。根据Box－Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素5水平的响应面试验（表2）。

表2 羊耳菊种子生活力测定条件响应面试验的因素及水平Table 2 Factors and levels in Box－Behnken experimental design for seed viability testing of I.cappa

1.4 数据分析

数据分析软件采用SPSS16.0和Design Expert 8.0.6软件，P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

由表3可知，羊耳菊种子生活力最高（92%）的处理组合染色温度40℃，TTC浓度1.0%，染色时间3h；生活力最低（29%）的组合为染色温度30℃，TTC浓度0.5%，染色时间1h。将所得的数据进行方差分析结果（表4）表明，染色温度差异极显著，TTC浓度和染色时间均差异不明显，3个因素对羊耳菊种子生活力测定影响的大小排序为染色温度＞染色时间＞TTC浓度。

2.2 单因素试验结果

由图1看出，染色温度在25～40℃时，种子的染色率随温度升高而升高。但当温度达到40℃后，随着温度升高，种子染色率增加缓慢。因此最佳测定温度定为40℃左右。羊耳菊种子染色率随着TTC浓度的增加而升高，当TTC浓度达到1.5%时，种子染色率最高，当浓度再增大时，种子染色率反而降低，因此将最佳测定浓度定为1.5%。染色时间在1～3h时，种子的染色率随染色时间延长而升高。但当时间达3h后，时间再延长，种子染色率增加缓慢。因此最佳测定时间定为3h左右。

表3 羊耳菊种子生活力测定正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

表4 羊耳菊种子生活力测定正交法试验的方差分析结果Table 4 ANOVA for orthogonal experiment for seed viability testing of I.cappa

图1 不同染色温度、TTC浓度和染色时间种子的染色率Fig.1 Dyeing rate with different dyeing temperature，TTC concentration and dyeing time

2.3 响应面试验结果

2.3.1 模型的建立 利用Design Expert 8.0.6软件对表5的数据进行多元回归分析，得回归方程为。对模型进行方差分析（表6），F＝ 80.59，且P＜0.001，模型差异极显著。模型中决定系数R2为0.986 4，调整决定系数RAdj2为0.974 2，表明响应值为89.67%的变化来源于所选变量。模型的变异系数为5.16%（＜10%），表明试验有良好的稳定性。模型的信噪比为29.406（＞4），表明该模型适用于种子生活力测定指标的优化。对模型系数的显著性进行检验，结果表明和x3对羊耳菊种子生活力测定影响极显著，各因素及其一次项和二次项对羊耳菊种子生活力测定的影响显著，且3个因素对种子生活力测定的影响顺序为染色温度＞染色时间＞TTC浓度。

表5 羊耳菊种子生活力测定响应面试验结果Table 5 Experimental results of Box－Behnken for seed viability testing of I.cappa

2.3.2 响应面分析 响应面图能直观体现各两个因素的交互作用对种子生活力响应值的影响，响应曲面的坡度越陡峭，则表明两个因素的交互作用对种子生活力测定响应值的影响越显著。从图2看出，染色温度和TTC浓度、染色温度和染色时间、TTC浓度和染色时间对种子生活力测定可产生影响，这与方程的方差分析结果一致。

表6 羊耳菊种子生活力测定响应面试验的方差分析结果Table 6 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table for seed viability of I.cappa

图2 各因素交互作用对生活力测定影响的响应面Fig.2 Response surface of interaction between every two factors on testing seed viability

2.3.3 最佳测定条件确定 经过Design Expert8.0.6软件的分析，羊耳菊种子生活力测定的最佳条件为染色温度40.84℃，TTC浓度1.578%，染色时间3.15h，在此测定条件下羊耳菊的生活力为98.396 5%。为验证方法的可行性，采用上述方法测定羊耳菊种子生活力，将其条件改为染色温度40℃，TTC浓度1.5%，染色时间3h，在此条件下测定生活力进行3组平行试验，平均生活力为98.05%。该结果与理论预测值相差0.346 5%，充分说明响应面分析法对羊耳菊生活力测定条件进行的优化可靠，有实用性。

3 结论与讨论

1）尽管不同植物的种子用四唑染色法测定生活力时其适宜的测定条件各不相同，但一般选取TTC浓度、染色温度和染色时间为检测指标。如白花前胡种子生活力测定的最佳条件以浸泡时间、TTC溶液浓度、染色温度和染色时间为检测指标［18］；测定巨紫荆种子生活力的最佳条件以TTC浓度、染色温度和染色时间为检测指标［19］。因此，笔者等以TTC浓度、染色温度和染色时间为考察因素，测定羊耳菊种子生活力的最佳测定条件。白花前胡［18］和巨紫荆［19］种子生活力测定的最佳条件分别为TTC浓度1g／L、染色温度35℃、染色16h 和TTC浓度0.1%、染色温度35℃、染色时间为8h。由此可知，TTC浓度、染色时间和染色温度的不同都会影响种子生活力的判断，何伶俐［18］研究得出，染色温度低于30℃和TTC液浓度高于5g／L时，白花前胡种子不染色或染色情况极差，将温度设置在35℃左右，TTC液浓度在5g／L以下。凌敏［19］发现，TTC浓度低于0.10%和染色温度高于50℃时，巨紫荆种子不染色或者染色情况较差，故将TTC浓度设置高于0.10%，染色温度低于50℃。本试验在种子生活力测定前，也对羊耳菊种子生活力的TTC浓度及染色温度做了简单对比，结果表明TTC浓度低于0.5%，温度高于50℃时，羊耳菊种子不染色或染色情况差，因此试验时将TTC浓度设置高于0.5%，温度低于50℃。

2）测定种子生活力染色前不同种子切割方法不同。白花前胡种子吸水膨大后取出，用刀片沿种子胚的中心线纵切为两半［18］。栀子种子［20］用刀片沿种子胚中轴纵切成两半。益母草种子［21］用刀片在距胚端3／4横切，带种胚部分进行染色。本研究中羊耳菊种子细小，胚难以取出，横切面直径很小，因此靠近胚端方向1／4纵切，带种胚部分进行染色。

3）中心复合设计－效应面法是近年来应用较多的一种优化方法。优化当归多糖提取工艺时，盛小莉等［22］用正交法，以浸泡时间、加水量、提取时间和提取次数为考察因素，结果发现4个因素对结果均无显著性影响，只能依据直观分析结果确定最佳条件；但王艳艳等［23］和纪鹏等［24］分别用效应面法时，均得到4个因素对当归多糖得率影响均较显著，并结合回归方程和响应面结果图确定最佳工艺条件。此外，在优化丹参提取工艺时，李绍林等［25］用正交法，以提取次数、提取时间、醇浓度和溶媒量作为考察因素，只有提取次数对提取结果具有显著性影响；而黄元红等［26］用效应面法得到4个因素影响均较显著，并结合回归方程和响应面结果图确定最佳工艺条件。效应面法能考察各因素间的相互作用，试验次数少，精密度高。将效应值对影响因素作曲面图，直接读取，有直观、精密的优点。集数学和统计学方法于一体使结果更加科学可靠，在药学应用上成效显著［27］。但至今未有将此方法应用于种子方面的研究。笔者分别用正交法和效应面法进行数据分析，以生活力大小为指标考察羊耳菊种子生活力的最佳测定条件，得到染色温度40℃、TTC浓度1.5%、染色时间3h为羊耳菊种子生活力测定的最佳条件，且3个因素对种子生活力测定的影响顺序为染色温度＞染色时间＞TTC浓度。与正交设计分析法相比较，响应面分析法在试验设计和结果表达方面更加优良，可作为四唑染色法测定羊耳菊种子生活力的方法。

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（责任编辑：聂克艳）

Optimal Determination Method of Seed Viability of Inula cappa

CHENG Xiaolu，WEI Yibing，WEI Shenghua＊，TAN Longyan

（College of Pharmacy，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

In order to find out the best determination conditions of seed viability of I.cappa，the method of 2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride（TTC）was employed with indicators of TTC concentration，dyeing temperature and dyeing time，and the determination conditions were optimized by using orthogonal method and response surface methodology.Results：1.5%，40℃，3hwere the best dyeing conditions of TTC concentration，dyeing temperature and dyeing time respectively.And the order of the three factors influencing seed viability test is dyeing temperature＞dyeing time＞TTC concentration.

Inula cappa；seed；viability；2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride dyeing method

S567

A

1001－3601（2016）08－0350－0100－05

2015－12－30；2016－08－08修回

国家中医药管理局项目“国家基本药物目录原料种子种苗繁育（贵州）基地建设”（2014－2015）；贵阳中医学院博士基金项目“羊耳菊野生变家种技术研究”（2015）

成小璐（1991－），女，在读硕士，研究方向：中药与民族药品质量及鉴定。E－mail：930368512＠qq.com

＊通讯作者：魏升华（1965－），男，副教授，从事药用植物资源、引种驯化、中药材生产与民族医药开发等的教学和研究。E－mail：weishenghua6512＠126.com