白芨实生种子的快速繁殖技术

李 川，李二星，刘 洋，吴群军，殷越阅

（1.安康学院现代农业与生物科技学院，陕西安康725000；2.旬阳县新森林生态农业有限责任公司，陕西旬阳725772）

白芨实生种子的快速繁殖技术

李 川1，李二星1，刘 洋1，吴群军2，殷越阅1

（1.安康学院现代农业与生物科技学院，陕西安康725000；2.旬阳县新森林生态农业有限责任公司，陕西旬阳725772）

为白芨种质资源的保存和大面积种植提供依据，以白芨种子作为接种材料，利用正交试验研究在不同条件下白芨种子的萌芽率，不同激素浓度白芨种子成苗率及白芨种子实生苗炼苗成活率的条件。结果表明：贮藏条件为20℃，30d的白芨种子在培养温度为25℃，光照16h／d的萌发率最高；培养基配比为MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%，光照16h／d，温度25℃条件下白芨种子的萌发最快，长势较好，而MS＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%对于诱导生根效果明显；炼苗基质以腐叶土∶锯末＝1∶1为最好，控制温湿度，成活率超85%。

白芨种子；实生苗；原球茎

白芨〔Bletilla striata（thunb）Reichb.f.〕兰科植物，别名地螺丝、刀口药和白芨子。主产于贵州、云南和四川等地，在长江流域及以南各省亦有分布［1］。白芨种子细小，在自然条件下萌发率极低，繁殖困难，野生资源较稀少，而白芨用途广，需求量极大，长期掠夺式的采挖导致其野生资源已濒临枯竭，无法满足市场需求。因此，必须探索白芨实生种子繁殖技术，在相对较短的时间内进行白芨苗的快速繁殖，增大白芨产量，以解决白芨缺乏的现状。石云平［2］等研究表明，以白芨侧芽为外植体并采用0.2%升汞消毒灭菌8min的效果较好；侧芽的丛生芽诱导以培养基MS＋1.5mg／L 6－BA＋0.1mg NAA的效果较好；继代增殖以培养基MS＋2.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA较适合，30d为1个周期，增殖系数为5.0；生根培养基以1／2MS＋1.0mg／L NAA＋0.1mg／L 6－BA较好，生根率为83.3%。付志惠［3］等研究表明：白芨种子萌发率与其胚龄和有胚率成正相关，萌发时间则与胚龄和有胚率成负相关；胚龄16周的种子在1g／L花宝1号＋2g／L花宝2号的培养基上萌发率达84%；胚龄≥20周的种子萌发率不受培养基成分的影响，均达100%，萌发时间只需7d；丛生芽增殖的最佳培养基为1／2MS＋4.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA＋100g／LCM，其增殖倍数达4.41倍；诱导生根较好的培养基为1／2MS＋0.2mg／L NAA，生根率达90%。但目前对于白芨实生种子方面研究尚少。因此，笔者以白芨种子作为接种材料，利用正交试验研究不同条件下白芨种子的萌芽率，不同激素浓度对白芨种子萌发及实生苗炼苗成活率的影响，旨在讨论利用白芨种子进行实生苗组织培养快速繁殖，为该物种种质资源的保存和大面积栽培利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为黄花白芨（当地品种）种子，由旬阳县新森林生态农业有限公司提供。

1.2 无菌材料的获得

将未开裂白芨蒴果果荚用毛笔轻轻扫去附着在表面的灰尘，在超净工作台上用75%的酒精棉擦拭表面消毒3min，再用0.15%的HgCl2擦拭表面约10min（操作过程中只需擦湿表面即可，以防试剂浸入蒴果内部导致种子失去萌发能力）。然后用镊子纵向剖开蒴果，用镊子夹住蒴果，将碎末状的种子轻轻抖落在培养基表面。利用pH为5.8，琼脂为8.0g／L的培养基培养果荚里粉末状白芨种子，以获取白芨苗。

1.3 白芨种子最适萌发条件的确定

采用3因素3水平正交设计法L9（33）考察不同条件对白芨种子萌发的影响因素水平（表1）。在垫有3层滤纸直径90mm的培养皿中按10×10方阵精量播100粒种子，每个处理培养2皿，每天洒水1次，保证100%的湿度。接种15d后统计9个处理白芨种子的萌发个数，计算不同处理的萌发率：

萌发率＝（萌发的种子数／接种的种子数）× 100%

表1 白芨种子萌发的L9（33）正交试验设计Table 1 L9（33）orthogonal experimental design table for Bletillaseeds germination

1.4 白芨种子萌发的最佳浓度激素配比的确定

选择萌发率较高的白芨种子在6－BA （1～3mg／L）和NAA（1～2mg／L）不同激素浓度配比的MS培养基中培养，激素浓度为6－BA∶NAA＝1∶1，1∶2，2∶1，2∶2，3∶1，3∶2），筛选出培育白芨种子组培苗的最佳配比浓度。其他条件为pH 5.8，蔗糖30g／L，琼脂8g／L。在25℃，光照16h／d，光强2500～3000lx环境条件下培养。

1.5 不同浓度NAA对白芨生根的影响

待白芨幼苗生长到2～3cm时，将幼苗转接入生根培养基诱导生根（NAA激素浓度分别为0.5mg／L，1mg／L，1.5mg／L，2mg／L）。试验所用培养基为MS培养基，pH 5.8，蔗糖含量为30g／L，琼脂为8g／L。在25℃，光照16h／d，光强2 500～3 000lx环境条件下培养。

1.6 炼苗

当白芨组培苗生根达4～5条，平均根长度达1.5cm，株高约5cm时，即可进行移栽。移栽前打开组培瓶盖，在自然环境下放置3d，小心取出白芨幼苗，用自来水将根系上的培养基冲洗干净，最后定植于已高温消毒的基质中，基质为锯末∶腐叶土＝1∶1较好，室温，光照16h／d，光强2 500～3 000lx的光照培养箱中炼苗。

1.7 数据处理

采用EXCEL2010和SPSS 19.0软件进行数据统计分析。

表2 不同处理对白芨种子的萌发率Table 2 Germination rate of Bletillaseeds of different treatment

2 结果与分析

2.1 不同处理白芨种子萌发率与长势

2.1.1 不同培养条件 由表2可见，不同成熟度的白芨种子在不同培养温度和不同光照时间中均能萌发，但萌发率有所差异。不同处理白芨种子的萌发力影响依次为培养温度＞贮藏条件＞光照时间，选择贮藏条件20℃，贮藏30d当年的白芨种子，培养温度为25℃，光照16h／d的处理组合萌发率最高，达95%。

表3 不同激素和浓度配比白芨种子生长情况Table 3 Growing status of Bletillaseeds treated with different hormone and concentration ratio

图示 白芨种子在培养基上不同时期生长情况Fig. Growth of different periods of Bletillaseeds in culture medium

经方差分析，温度（A）和光照（C）对白芨种子萌发影响达显著水平（P＜0.05），种子成熟度（B）对白芨种子萌发影响不显著。由温度和光照条件多重比较结果可知，温度为25℃与30℃时差异不显著，但温度为20℃时与前两者差异显著；光照时长为0与16h／d时差异不显著，但光照时长为24h／d时与前两者差异显著。

2.1.2 不同激素浓度 由表3可见，在培养基中添加适量激素对白芨的萌发有促进作用，萌发率相对于无激素的培养基有所提高，萌发速度较快。不同激素和浓度配比对白芨的萌发与幼苗的形成效果有明显的差异。当培养基中NAA含量较高时白芨种子萌发较慢，萌发率相对较低，在种子萌发形成原球茎表面逐渐长出一些乳白色瘤状小突起，继续培养可发育成丛生苗；其次发现，一定范围内当6－BA含量逐渐升高时形成的原球茎逐渐增大，在激素浓度较高时幼苗生长较高。观察发现，当6－BA∶NAA＝3∶1时白芨幼苗长势最好，35～40d后可见2～3片叶，幼苗平均可达3.1cm且叶为深绿色，长势健壮（图示）。

2.2 不同激素和浓度白芨根的长势

将白芨幼苗转入生根培养基20～30d后可观察到在不同激素浓度下白芨幼苗生根率均在95%以上，生根率较高，且幼苗高度达5cm左右，得到壮苗，可看到膨大的原球茎（图示）。由不同激素和浓度配比白芨种子的萌发与长势可见，添加NAA对白芨生根有显著作用，当NAA浓度高于1mg／L时幼苗逐渐出现黄化现象，不利于日后幼苗成活。当NAA浓度为1mg／L时幼苗生根效果最好，幼苗健壮。

2.3 白芨炼苗的培养条件

将白芨幼苗移栽到腐叶土∶锯末＝1∶1的基质中保证遮光率达90%左右的环境下，用黑色遮阳网全遮盖，每天喷雾状水，空气湿度在80%～90%即可，过湿则幼苗很快烂根死亡，温度一般保持在（25±2）℃，30d后白芨可长出新根系。

3 结论与讨论

1）张建霞［5］等研究表明，随着白芨胚龄增大，胚成熟度逐渐增加，有胚率逐渐提高，种子萌发时间逐渐变短。胚龄为20周时采收最好，有胚率最高，萌发率100%，萌发只需1周。白芨果荚一般在每年7－9月成熟［6］，本发芽率试验在11月进行，通过试验发现，不同贮藏条件的白芨种子均能萌发，但以室温20℃，贮藏期较短的萌发率最高，温度较低和储藏时间过长发芽率相对较低，结果与赵仁全［7］等研究相似，说明白芨种子不存在后熟，贮藏时间越长，种子易老化或发生劣变影响萌发率。

2）当培养基配比为MS＋6－BA3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%，培养条件为光照16h／d，温度25℃时，白芨种子萌发最快，幼苗生长最佳。而MS＋NAA 1.0mg／L＋蔗糖30%时，对于诱导生根效果明显，说明NAA在白芨丛生芽增殖中期主导作用，与袁宁［8］等得到的结果相似，其他结果与前人研究结果存在差异［4－5，9－11］，可能与种子的选择和地域差异有关。

3）张建霞等［5］发现，白芨种子在萌发过程中对培养基的依赖性很低，萌发后可直接分化出叶原基和根原基，长成健苗。吴华芬等［12］研究表明，白芨原球茎诱导、增殖及分化成芽等过程可在同一培养基上进行。在此试验之前，在大田条件下利用腐殖土直接播种，约14d后利用放大镜可观察到白芨已经形成黄绿色的原球茎，60d后可明显观察到白芨幼苗1片子叶展开，高2mm左右，说明，完全成熟的白芨种子含有的营养物质能够提供种子萌发需要，但由于白芨自身营养不足在种子萌发的后期不足以维持幼苗继续生长，故幼苗生长到一定时间会逐渐黄化死亡。在白芨种子萌发形成幼苗后通过放大镜可以观察都茎基部有白色绒毛状物，可能为原球茎表皮发生的表皮毛，是具有吸收能力的“假根”［5］。试验中用肉眼同样可观察到白芨根部存在白色绒毛状物，可能与其自然生长中情况下的“菌根”有关，利于共生菌的附着，可深入研究形成机理及其共生菌类型及对白芨生长的作用。白芨实生种子快速繁殖幼苗长势较好，能顺利移栽到大田，进行大田生产。

4）根据白芨生长习性可知，白芨喜欢生长在湿润疏松的土壤中，余朝秀等［4］经过多次对比试验发现，炼苗前期的空气湿度在80%～90%，温度一般保持在（25±2）℃，使用腐叶土∶锯末＝1∶1的基质中白芨成活率最高，达85%以上。但通过本试验研究发现，将白芨幼苗移栽到遮光率达90%时，每天喷雾状水，湿润即可，过湿则幼苗很快烂根死亡。经过30d左右的精心管理白芨可长出新根系，炼苗阶段结束，即可转入常规管理。

［1］谢凤勋，胡廷松.中药原色图谱及栽培技术［M］.北京：金盾出版社，2002：217－218.

［2］石云平，李 锋，凌征柱.白芨组织培养与快速繁殖技术研究［J］.广西农业科学，2009，40（11）：1408－1409.

［3］付志惠，张建霞，李洪林，等.白芨种子萌发与快速繁殖技术的研究［J］.武汉植物学研究，2006，24（1）：80－82.

［4］余朝秀，李枝林，王玉英.野生白芨组培快繁技术研究［J］.西南农业大学学报，2005，27（5）：601－604.

［5］张建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚发育与种子萌发的关系［J］.亚热带植物科学，2005，34（4）：32－35.

［6］张卫明.中国植物胶资源开发研究与利用［M］.南京：东南大学出版社，2008（11）：161.

［7］赵仁全，罗光琼，张秀月，等.贮藏温度对白芨种子寿命的影响［J］.贵州农业科学，2007，35（4）：105－107.

［8］袁 宁，何俊蓉，何 锐，等.白芨组培快繁育苗技术研究［J］.西南农业学报，2009，22（3）：781－185.

［9］张 燕，黎 斌，李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生［J］.西北植物学报，2009，29（8）：1584－1589.

［10］朱玉球，王雪根.黄花白芨组培快繁技术［J］.浙江林学院学报，1999（6）：167.

［11］叶 静，郑晓君，管常东，等.白芨的无菌萌发与组织培养［J］.云南大学学报：自然科学版，2010，32（S1）：422－425.

［12］吴华芬，姚 宏，刘南祥，等.离体培养丽水野生白芨快速繁殖［J］.北方园艺，2008（6）：180－182.

（责任编辑：刘忠丽）

Rapid Propagation Technique of Bletilla Seeds

LI Chuan1，LI Erxing1，LIU Yang1，WU Qunjun2，YIN Yueyue1
（1.School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang，Shaanxi 725000；2.Xunyang New Forest Ecological Agriculture Co.Ltd.，Xunyang，Shaanxi 725772，China）

To provide references for germplasm resources preservation and large area planting of Bletilla，taking Bletilla seeds as the inoculating materials，orthogonal experiments were employed to study the germination rates of Bletilla seeds under different conditions，seedling rates of Bletilla seeds treated with different concentrations of hormones and the surviving rates of hardening－seedlings.Results：Germination rates of Bletillaseeds stored at 20℃for 30dreached the highest when culture temperature and illumination were 25℃and 16h／d respectively；Bletilla seeds germinated the fastest with good growth vigor under conditions of culture medium MS＋6－BA 3.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋sucrose 30%，illumination 16h／d，temperature 25℃.Culture medium MS＋NAA 1.0mg／L＋sucrose 30%had significant root inducting effects；The matrix leaf mould∶saw dust＝1∶1had the best hardening－seedling effects，the surviving rate could be above 85%when the temperature and humidity were controlled properly.

Bletillaseeds；seedling；protocorm

S567.23＋9

A

1001－3601（2016）08－0351－0105－04

2015－06－25；2016－07－02修回

陕西省科技厅项目“白及种苗繁殖及标准化栽培技术研究”（2015SF305）；陕西省教育厅项目“白及种质资源保护与驯化快繁技术研究”（2013JK0730）；安康学院项目“白及种子繁殖技术研究”（AYQDZR201004）；陕西省大学生科技创新项目（2014Sxjy－1799）

李 川（1976－），副教授，硕士，从事植物种质资源遗传育种研究。E－mail：cyberlc＠163.com