新疆巴州地区布鲁氏菌流行株分子生物学鉴定

李金平， 薛　晶，王海军， 刘丽娅, 马晓菁，叶　锋，钟　旗， 易新萍,*

(1.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所,陕疆 乌鲁木齐830063；2.新疆畜牧科学院兽医研究所；3.新疆伊犁地区新源县兽医站)

新疆巴州地区布鲁氏菌流行株分子生物学鉴定

李金平1， 薛晶2，王海军3， 刘丽娅2, 马晓菁2，叶锋2，钟旗2， 易新萍2,*

(1.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所,陕疆 乌鲁木齐830063；2.新疆畜牧科学院兽医研究所；3.新疆伊犁地区新源县兽医站)

摘要：为新疆制定布病综合性防控措施提供科学依据和技术支撑，本研究应用分子生物学方法辅助鉴定了新疆巴州地区畜间布病流行分离株。2014年从新疆巴州地区收集流产羊胎儿21份，体内分离出疑似布鲁氏菌8株，采用分子分型方法(AMOS-PCR)和生物学分型方法对分离株进行进一步鉴定，结果表明8株分离株均为羊种布鲁氏菌，传统细菌分类学鉴定8株布鲁氏菌均为羊种生物3型。应用AMOS-PCR方法可以安全、快速对布鲁氏菌流行株进行种型鉴定，以期为新疆布病的综合防控措施的制定提供科学依据。

关键词：新疆；布鲁氏菌；鉴定

布鲁氏菌病(brucellosis，布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种以流产和发热为特征的人兽共患传染病，流行于世界各地。新疆是布病老疫区，历史上主要以羊种菌和牛种菌为优势种型。近年来，随着规模养殖的兴起和牲畜流动的加快，布鲁氏菌病在畜间发病率呈明显上升趋势。带菌动物是其他动物和人类布病的主要传染源，因此，从源头遏制畜间布病疫情上升趋势是控制人间布病的重要前提。为全面了解新疆巴州地区牛羊布鲁氏菌病发生现状，对该地区开展了牛羊布鲁氏菌病流行病学调查，根据调查结果，分析该地区布病防控存在的问题，并提出防治建议，为科学判断牛羊布鲁氏菌病流行趋势，确保牛羊布鲁氏菌病防控工作有序开展，及时有效控制布鲁氏菌病疫情的发生和蔓延提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1血清及病料采集巴州地区牛血清343份，羊血清2 188份。收集羊流产胎儿的脾脏、肝脏、胃内容物等病料，其中且末县4份；博湖县3份；和硕县5份；焉耆县3份；库尔勒市2份；轮台县4份，共计羊流产胎儿病料21份。

1.1.2菌株牛种布鲁菌A19疫苗株购自天康畜牧生物技术股份有限公司。国际标准参考菌株羊种菌16M及羊种3型菌株由本室保存。

1.1.3试剂硫化氢滤纸片、硫堇、碱性复红染料滤纸片、噬菌体，单项凝集血清A、M、R均由中国CDC传染病预防控制所布病室提供；SAT凝集抗原购于中国哈药集团生物疫苗有限公司；布氏琼脂培养基购自美国BD生物公司；分子生物学试剂购买自北京庄盟生物技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1SAT血清学检测按照国家标准方法《动物布鲁氏菌病诊断技术》GB/T 18646-2002对采集的牛羊血清进行布病血清学凝集实验(SAT)检测。1.2.2布鲁氏菌分离培养将流产胎儿病料放置无菌间的生物安全柜内，分别取脾脏、肝脏和胃内容物直接涂抹于布氏琼脂培养基上， 37 ℃，含5%CO2培养箱中培养3 d并观察。1.2.3布鲁氏菌属的PCR鉴定挑取疑似布鲁氏菌落于500 μL布氏液体培养基中，37 ℃培养箱内孵育增菌72 h，菌液于85 ℃灭活1 h。取灭活菌液作为PCR模板，采用VirB8-PCR扩增布鲁氏菌的VirB8基因，进行布鲁氏菌属鉴定。引物及扩增体系均参考进行。1.2.4布鲁氏菌种的AMOS-PCR鉴定将VirB8-PCR鉴定阳性的布鲁氏菌液进一步进行布鲁菌种/型的AMOS-PCR鉴别。引物及扩增体系均参考进行。1.2.5布鲁氏菌生物型的生化鉴定按照布鲁氏菌标准鉴定方法进行布鲁氏菌分离株的生物型鉴定。以Brucella牛种A19菌株和羊种16M为实验参考株进行生化鉴定试验。试验中CO2需要、H2S产生、染料抑菌试验(硫堇和复红)、单项特异性血清凝集试验等结果均成立条件下判定分离株的生物亚型。

2结果与分析

2.1SAT检测结果

新疆巴州地区规模化牛场和散养牛的布病抽查检测结果未发现牛布病阳性，但是羊布病阳性率达1.05%。结果见表1。

表1　牛羊血清布病SAT检测结果

2.2布鲁氏菌的分离

21份病料在布氏琼脂培养基上培养生长3 d后，8份样品的培养基上可见生长的菌落较小，无色透明、圆形、湿润、表面光滑的菌落。

2.3布鲁氏菌属的VirB8-PCR鉴定结果

分别挑取8个平板培养基上的疑似菌落进行72 h增菌实验并灭活菌液。以牛种布鲁菌A19疫苗株和大肠杆菌DH5α分别为阳性对照和阴性对照。VirB8-PCR鉴定结果表明，8个疑似菌均扩增出约713 bp的特异性片段，与布鲁菌阳性对照一致。阴性对照大肠杆菌DH5α则未见特异性目的片段(图1)。

图1　流产胎儿病料的布氏鲁菌分离株的VirB8-PCR鉴定

2.4AMOS-PCR 检测结果

应用AMOS-PCR方法对8株VirB8-PCR阳性布鲁氏菌分离株进一步进行种型鉴定， AMOS-PCR结果表明，牛种布鲁氏菌A19扩增出498 bp的特异性片段；羊种布鲁氏菌16M扩增出731 bp的特异性片段；8株布鲁菌分离株扩增片段大小与羊种布鲁氏菌一致(图2)。

图2　流产胎儿中布鲁菌分离株种型的AMOS-PCR鉴定

2.4生化鉴定

应用常规生化试验对AMOS-PCR鉴定的羊种Brucella进行生物亚型鉴定。以牛种布鲁氏菌A19和羊种布鲁氏菌16M羊种3型菌株做阳性对照，采用布鲁氏菌单相特异性血清A、M、R 分别与待检菌株的72 h培养物进行玻片凝集试验，同时还进行CO2需要、H2S产生、染料抑菌试验。结果表明,分离的8株细菌对CO2无依赖，不产生H2S、硫堇和碱性复红染料培养基中均能生长(表2)。

表2　布鲁菌分离菌株生化鉴定结果

3讨论

从全国近年的布鲁氏菌分离鉴定结果看， 羊种3型布鲁菌是我国人感染布病的主要流行菌型，其次是牛种菌。据报道，新疆2014年人间布病病例新增约7000例，比2013年增加了一倍。由于布病往往先在家畜或野生动物中传播，随后波及人类，人间布病与畜间布病疫情呈正相关性。对新疆巴州地区5县1市的牛羊布病抽查监测结果表明，羊布病阳性率达1%，因此，从源头遏制羊布病疫情的上升趋势是控制人间布病的必要途径。

经典的生化实验是布鲁氏菌分类鉴定的主要方法，但该鉴定方法耗时、操作繁琐且存在实验室生物安全隐患。PCR方法以敏感、特异、安全等优点被广泛应用于布鲁氏菌的鉴定。各型布鲁氏菌在各种动物间有跨物种间传播，即羊种布鲁氏菌可能转移到牛、猪，或相反，因此，确认动物感染群及其病原的种型，对确定流行病学状态、传染源及采取合适的防控措施有着重要的实用价值。本研究应用VirB8-PCR法对疑似分离菌进行布鲁氏菌属的鉴定，然后以AMOS-PCR进一步对其进行布鲁氏菌种型鉴定，快速准确地对2014年新疆巴州地区分离的8株疑似菌均为羊种布鲁氏菌。该方法减少了操作者在不可控情况下接触活菌的机会，极大地降低了布鲁氏菌扩散污染的生物安全问题。结合传统的生化试验对其进行进一步生物亚型鉴定，结果表明分离的8株菌为羊种布鲁氏菌生物3型。结果与近几年山西、贵州、广东、辽宁等省检出菌型一致。提示对羊布病的监测检疫是目前动物布病防控工作要点。

综上所述，应用PCR和AMOS-PCR的分子生物学方法将提高牛羊布病的筛查及种型鉴定时间，对及时掌握传染源的流动和分布的动态情况调查提供了科学依据。就新疆目前人畜间布病疫情情况而言，为了尽快遏制人间布病发病率上升趋势和动物布病疫情的蔓延，加强羊布病的监测、检疫、控制无检疫羊群频繁交易等活动的防控措施是十分关键和必要的。

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Molecular Biological Identification of the Epidemiological Strains of Brucella In Xinjiang

LI Jin-ping1，XUE Jing2，WANG Hai-jun3，LIU Li-ya2，MA Xiao-jing2,YE Feng2, ZHONG Qi2, YI Xin-ping2,*

(1.XinjiangUygurAutonomousRegionAnimalHealthEpidemicSupervisionInstitute，UrumqiXinjiang830063；2.VeterinaryResearchInstitute,XinjiangAcademyofAnimalSciences; 3.XinyuanCountyVeterinaryStationinYiliRegion)

Abstract:In order to formulate comprehensive measures of prevention and control brucellosis and provide the scientific basis and technical support, the molecular biology method to identify epidemiological strains of livestock brucellosis with auxiliary was used in Bazhou area of Xinjiang in this study. In 2014, 21 aborted fetuses were collected from Bazhou in Xinjiang, 8 strains of suspected Brucella were isolated from the fetuses, and molecular classification method (AMOS-PCR) and biological typing method were used to further identify the isolates. The results showed that 8 isolated strains were identified as Brucella melitensis, 8 strains of Brucella identified as Brucella melitensis biovar 3 by traditionaly bacterial taxonomy. Using AMOS-PCR method can safely and fastly identify the types of epidemiological strains of Brucella. This study can provide the scientific basis for the establishment of comprehensive measures of prevention and control brucellosis in Xinjiang.

Key words:Xinjiang uygur autonomous region; Brucella; identification

[收稿日期]2015-09-14

[基金项目]新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目(201311102)

[作者简介]李金平(1962-),女，汉族，本科，高级兽医师，从事动物布病监测工作。

*[通讯作者]易新萍(1970-)，博士，研究员，从事动物布病诊断技术与防治研究工作。

[中图分类号]S 852.614

[文献标识码]A

[文章编号]1004-6704(2016)01-0020-04