植骨联合烤瓷夹板修复末端松动基牙龈下牙周致病菌的分析

王　毅，胡　杨，杜　军，何惠宇

(新疆医科大学1附属中医医院口腔科，乌鲁木齐　830000; 2第一附属医院口腔修复科，乌鲁木齐　830054)

植骨联合烤瓷夹板修复末端松动基牙龈下牙周致病菌的分析

王毅1，胡杨2，杜军1，何惠宇2

(新疆医科大学1附属中医医院口腔科，乌鲁木齐830000;2第一附属医院口腔修复科，乌鲁木齐830054)

摘要：目的通过对基牙龈下牙周可疑致病菌进行动态监测及定量分析，探讨在保留KennedyⅢ末端松动基牙后，应用牙周植骨术联合夹板式金属烤瓷冠桥的方法，观察龈下牙周致病菌的变化。方法选取20例伴有牙周病骨缺损的KennedyⅢ末端基牙松动的患者，试验组为10例行植骨术联合夹板式金属烤瓷冠桥修复，对照组为单纯10例行夹板式金属烤瓷冠桥修复。在修复后0、3、6个月行完善的牙周相关检查并收集龈沟液，菌落计数，并采用聚合酶链反应(PCR)法，检测伴放线放线杆菌(Aa)、牙龈卟啉单胞菌(Pg)、中间普氏菌(Pi)、具核梭杆菌(Fn)4种慢性牙周炎相关致病菌。结果试验组与对照组的菌落计数结果差异无统计学意义；与对照组相比，两组间4种牙周可疑致病菌的检出率差异无统计学意义。两组的CAL值、PD基线情况比较无统计学差异；治疗后0、3、6个月植骨组牙周指标结果：CAL、PD在3、6个月均显著下降，而非植骨组牙周指标较前无统计学差异；X线片显示两组病例基牙牙槽骨无进一步吸收，并且植骨组术后牙槽骨量有一定程度增加。结论对于KennedyⅢ牙列缺损末端松动基牙，牙周植骨术联合夹板式金属烤瓷冠桥修复，较单纯的牙周植骨术或夹板式金属烤瓷冠桥的修复方法更利于保持患牙的健康，可获得较满意的近期临床疗效；与试验组与对照组的细菌分析结果相较，同时比较植骨组与非植骨组的临床疗效，发现牙周植骨术联合夹板式烤瓷联冠固定可有效促进牙周骨缺损基牙牙周组织的修复重建。

关键词：夹板式固定桥修复； 牙周植骨术； 牙周可疑致病菌

KennedyⅢ伴有末端倾斜松动基牙的修复治疗，在临床中仍以固定义齿修复居多，夹板固定可以显著减轻松动基牙的负担，有利于牙周组织恢复健康[1]。然而，单纯的夹板固定，可以使根周牙槽骨停止吸收，然而对于已经吸收的牙槽骨，却难以修复。近年来，多项研究证明[2-4]：牙周植骨术对于新附着的再生有一定的积极作用。对于有牙槽骨吸收的末端松动牙的修复治疗，将夹板式金属烤瓷冠桥与牙周植骨术联合应用，在去除创伤的前提下可以促进牙周骨组织再生，去除深的牙周袋，消除炎症，稳定末端松动基牙，提高了修复效果[5]。本研究通过观察修复治疗后0、3、6个月两种修复治疗方法的牙周致病菌的变化，为牙周植骨术联合夹板式金属烤瓷桥保留末端松动基牙的修复治疗手段，从微生物学方面提供相关的理论依据及参考。

1材料与方法

1.1研究对象2009年12月-2011年3月，在新疆医科大学第一附属医院口腔修复科门诊就诊，并符合纳入、排除标准的患者20例。随机分为试验组和对照组，每组10例。

1.2纳入标准诊断为慢性牙周炎轻、中度伴牙列缺损的患者，第一磨牙缺失，远端孤立松动牙，X线片显示：牙槽骨吸收达根中1/3～1/ 2，松动度为Ⅰ～Ⅱ度； 余留牙≥20 颗，余留牙情况较好，可以满足固定义齿修复条件； 具有良好的依从性，按时复诊。维护期主动进行菌斑控制；治疗前3 个月内未接受系统牙周治疗； 能够签署知情同意书。

1.3排除标准同时伴有高血压、糖尿病或遗传病史等全身系统性疾病的病人； 有金属过敏史的患者。

实验材料：人工骨粉、Bio-Gide、高纯度钯银合金、Vita95瓷粉、Chelex-100、蛋白酶K液、Taq酶、dNTPs、硫乙醇酸盐传送培养基、CDC厌氧血琼脂培养基、特异性引物、标准菌株。

1.4方法

1.4.1牙周植骨术(1)切开：改良Widman′s法沿牙龈缘切开，对于术野难以暴露的患牙，选择纵切口或横切口。(2)翻瓣：翻开黏骨膜瓣，骨缺损处行根面平整术、袋壁刮治术，尽量保留牙龈组织，邻面的牙龈组织沿切口处翻开，避免牙龈瓣损伤。(3)植骨：骨缺损区植入适量的羟基磷灰石骨粉，骨下袋则将人工骨植入袋底，塑形，适当加压。实验中，一壁骨袋、二壁骨袋采用生物膜(Bio-Gide)覆盖于植入骨外侧，根方超过牙槽骨2～3 mm，并在釉牙骨质界水平与根面紧贴，以防止植入骨粉颗粒溢出和上皮及结缔组织长入。(4)牙龈冠向复位：在黏骨膜瓣的根方钝性分离，适当上提，使其冠方达到或接近正常的颈缘位置，覆盖于膜的外侧。(5)缝合：褥式、8字缝合，牙龈覆盖植入材料，压迫止血后敷塞滞剂。(6)戴入临时冠：术后即刻戴入临时冠，以对敷用的塞滞剂起到保护的作用，同时对基牙起到的固定作用。(7)术后维护：术后7～10 d拆线，继续戴用临时义齿，术后1～2 w应用抗生素预防感染。漱口水连续含漱4～6周，控制菌斑，防止感染。前2个月每1～2周复查一次，局部洁治，消除菌斑。术后1 w软毛牙刷刷牙。术后2～3 w后可恢复正常刷牙和牙间清洁措施，并定期复诊进行牙周维护。术后3、6个月拍摄X线片，观察植骨后骨缺损处骨组织恢复情况。

1.4.2样本的收集和输送早晨11∶00—13∶00，采集前嘱患者20 mL清水漱口，隔湿干燥，用已高温消毒灭菌的40#吸潮纸尖插入修复体基牙唇、舌侧龈下或者牙周袋内停留15 s，取尖端2 mm，置于盛有2 mL硫乙醇酸盐的Ep管中，0℃下，尽快送至实验室，用振荡器充分震荡混匀30 s，取1 mL原液用于细菌培养，剩余原液-80℃低温保存。

1.4.3细菌培养取原液100 bL，用布氏肉汤增菌液稀释至10-4浓度。接种CDC厌氧血琼脂培养基上。将CDC厌氧血琼脂培养基置于10%CO2、10%H2、80%N2的气体环境中，37℃培养48 h。

1.4.4聚合酶链反应(PCR)检测细菌DNA提取及检测：(1)将EP管的冻存标本置于室温下自然解冻5 min，加无菌去离子水1 mL，晃动均匀，尽量让菌斑溶解充分和均匀。(2)将EP管放入低温高速离心机，调至温度：15℃，转速：12 000 r/min，开始离心4 min，结束后去除上清液。(3)将去除上清液的EP管加入5%的Chelex-100液 150 μL、20 mg/mL的蛋白酶K溶液4 μL，混合均匀。(4)把EP管放入涡旋振荡器，振荡频率调至2 500～3 000次/min，充分振荡25 min。(5)将EP管放入电热恒温水槽，温度调至55℃，水浴3 h，将样本冷却至常温。(6)将自来水煮沸，放入样本，使水始终保持在沸腾状态10 min。(7)将低温高速离心机调至12 000 r/min，4℃，放入EP管，离心4 min，吸取上清液，编号，-20℃保存。(8)用分光光度计检测已提取的细菌DNA的纯度。

1.4.4.1引物4种牙周致病菌的16SrRNA特异性引物序列见表1。

表1　4种牙周致病菌引物序列、退火温度及片段长度

1.4.4.2PCR反应体系及反应条件扩增体系25 μL，依次加入 10 mmol/LdNTPs0.5 μL，10 X Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl 2 2.5 μL，上下游引物均为(10 pmol/μL)各0.5μL,，DNA模板5 μL，2UTaqDNA聚合酶，无菌去离子水补足；参照此反应体系配制4种牙周致病菌的标准菌株的PCR反应体系，同等条件下进行PCR扩增。 反应条件为：预变性95℃5 min，变性95℃30 s，每种细菌的退火温度(表1)，延伸72℃1 min，经35个循环后，延伸72℃7 min，4℃保存。

1.4.4.3设置对照和PCR扩增产物的检测设置对照：牙龈单胞菌(Pg ATCC 33277)、伴放线放线杆菌(Aa ATCC 29523)、具核梭杆菌(Fn ATCC25586)、中间普氏菌(Pi ATCC 25611)的标准菌株的扩增产物做阳性对照，以蒸馏水代替DNA模板，其它成分不变的为空白对照。PCR扩增产物检测：吸取提取细菌的扩增产物6 μL，与大约1 μL DNA Loading Buffer混合均匀，加在点样孔内，依次按顺序点完所有样，包括阳性对照(标准菌株的PCR产物)及空白对照，最后点5 μL Marker(2000Ladder)；接通电源，调整电压为100 V，电流100 mA，30 min后根据目的片段大小通过凝胶成像仪观察并记录结果。

1.5统计学处理应用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析；对各组研究对象的检出率进行比较，应用χ2检验，检验水准α=0.05； 4种制病菌的数量用菌落数表示，菌落数应用菌落形成单位(CFU/mL)的对数值表示，进行重复测量方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.116SrDNA PCR产物的电泳结果龈下细菌标本中Pg、Aa、Fn和Pi的PCR扩增产物电泳鉴定结果见图1～4。

2.24种牙周致病菌在试验组与对照组患者龈下细菌中的阳性例数的检测结果在试验组中，Pg、Aa、Fn、Pi的阳性检出率分别为57%、30%、53%、73%；在对照组中Pg、Aa、Fn、Pi的阳性检出率分别为83%、43%、73%、87%。4种牙周致病菌(Pg、Aa、Fn、Pi)的检出例数及检出率见表2。在试验组及对照组中4种牙周致病菌在0、3、6个月的都有检出的情况，并随时间的推移检出数量有增多趋势，而增多趋势在对照组较试验组明显，结果见表3。4种牙周致病菌在试验组0、3、6个月菌落数量基本趋于稳定，而在对照组则呈现明显上升趋势，结果见表4。

注： M: marker； 0: 空白对照； S: 阳性对照； 1-10: 龈下细菌扩增产物图1 牙龈卟啉单胞菌(Pg)PCR 检测电泳图

图2　伴放线放线杆菌(Aa)PCR 检测电泳图

注： M: marker； 0: 空白对照； S: 阳性对照； 1-10: 龈下细菌扩增产物图3　核梭杆菌(Fn)PCR 检测电泳图

图4　中间普氏菌(Pi)PCR 检测电泳图

表24种牙周致病菌在试验组与对照组患者龈下细菌中的阳性/例数(%)

牙周致病菌试验组对照组χ2值P值牙龈卟啉单胞菌(Pg)17(57)25(83)1.8370.258伴放线放线杆菌(Aa)9(30)13(43)0.7400.216具核梭杆菌(Fn)16(53)22(73)1.1570.294中间普氏菌(Pi)22(73)26(87)0.0430.865

表3试验组、对照组中0、3、6个月4种牙周致病菌的检出例数

牙周致病菌24h3个月6个月试验组 牙龈卟啉单胞菌(Pg)566 伴放线放线杆菌(Aa)333 具核梭杆菌(Fn)565 中间普氏菌(Pi)688对照组 牙龈卟啉单胞菌(Pg)6910 伴放线放线杆菌(Aa)256 具核梭杆菌(Fn)4711 中间普氏菌(Pi)899

2.3试验组与对照组PD值的分析结果经检验，样本数据方差齐且满足协方差阵球形性，遂进行重复测量方差分析检测。实验组与对照组0、3、6个月时间点比较(F=1.256，P<0.05; F=51.217，P>0.05)，试验组与对照组之间PD值存在统计学差异(P<0.05)(表5)。同一组别不同时间点间比较试验组有统计学差异(P<0.05)，对照组无统计学差异(P>0.05)(表6)。

牙周致病菌0个月3个月6个月实验组 牙龈卟啉单胞菌(Pg)6.22±0.126.24±0.126.24±0.12 伴放线放线杆菌(Aa)5.90±0.235.97±0.226.00±0.18 具核梭杆菌(Fn)5.54±0.225.70±0.175.69±0.20 中间普氏菌(Pi)5.92±0.186.01±0.155.97±0.20对照组 牙龈卟啉单胞菌(Pg)6.13±0.066.20±0.076.36±0.06 伴放线放线杆菌(Aa)5.77±0.145.93±0.156.17±0.14 具核梭杆菌(Fn)5.67±0.205.78±0.185.93±0.37 中间普氏菌(Pi)6.03±0.196.23±0.176.43±0.33

表5　PD值重复测量实验结果方差分析表

时间试验组对照组0个月6.60±1.515.30±1.493个月2.90±0.884.70±1.256个月1.60±0.704.50±1.08

2.4试验组与对照组CAL值分析结果试验组与对照组之间CAL值存在统计学差异(P<0.05)(表7)。同一组别不同时间点间比较试验组有统计学差异(P<0.05)，对照组无统计学差异(P>0.05)(表8)。试验组基牙CAL值在第0、3、6个月随着时间的延长呈显著下降趋势，且在相同时间点比较试验组与对照组基牙CAL值有下降的趋势，试验组明显优于对照组。提示患牙牙周植骨后牙周骨组织高度得到恢复，使组织达到理想的牙周新附着，使炎症因素得到了更加有效的控制。

表7　CAL值重复测量实验结果方差分析表

时间试验组对照组0个月4.80±1.035.10±1.203个月2.70±0.684.60±1.356个月1.30±0.484.40±1.43

3讨论

牙周病引起牙槽骨吸收是牙齿松动最主要的原因之一，牙槽骨一旦被破坏吸收，很难自行重建[6]。牙周植骨术是一种采用骨或骨的替代品来修复牙周炎症造成的牙槽骨缺损的方法[7]。属再生性牙周手术，目的在于通过移植材料促进新骨形成，修复骨缺损，恢复牙槽骨的解剖形态，以达到理想的骨再生或新附着性愈合[8]。固定桥式夹板固定就是将多个患牙和健康牙连接成一个“多根巨牙”，组成一个新的咀嚼单位[9]。通过这样的方法，使咀嚼力通过夹板传递到更多牙上，减轻患牙负担，同时使夹板中每个牙的牙周膜得到充分的生理刺激，促进牙周组织健康[10]。本研究4种致病菌菌落计数进行比较，结果表明差异无统计学意义。试验组菌落计数，组内差异无统计学意义；但对照组菌落计数，组内差异却有统计学意义。分析本实验结果，4种慢性牙周相关致病菌试验组与对照组的菌落计数，统计学进行重复测量方差分析后，结果4种慢性牙周相关致病菌的菌落计数差异无统计学意义。虽然临床口腔牙周检查结果提示，试验组的临床表现明显优于对照组，但是细菌菌落计数没有明显差异，PCR法的检出率也无明显差异。由于口腔内环境比较复杂，加之唾液的流动等因素，尽管试验组植骨术去除了基牙牙周袋，改善了局部基牙的牙周情况，但是和整体比较，局部的改善并不会对整体有较为明显的影响。统计学显示，试验组菌落计数，组内差异无统计学意义；但是，对照组菌落计数，组内差异有统计学意义。试验组，主要是由于修复治疗过程中牙周植骨术的成功把原有的深的牙周袋消除，消除了松动因素，稳定了松动基牙。消灭了细菌滞留的空间。牙周炎症得以消除或者缓解，修复桥体稳定了植骨术，而植骨术又稳定了松动基牙，从而稳定了牙周病的发展，局部基牙牙周细菌定植生长受到抑制。3个时间点对比，菌落计数差异不大。而对照组因为没有完全去除局部基牙的牙周隐患，所以造成局部牙周厌氧菌的菌落计数有增高的趋势。前后时间点菌落计数差异有统计学意义。

从试验组数据可知，夹板式金属烤瓷冠桥联合牙周植骨术在修复牙周炎伴牙列缺损的同时可达到促进患牙牙周骨缺损修复，引导骨组织再生，使得新生骨组织的量和骨高度均有所增加，促使牙周生理环境得到一定程度的恢复和改善，炎症因子得到有效控制的目的。试验组经过联合治疗后术牙PD和CAL的均有所下降，不同时点测量结果有统计学差异。分析认为PD和CAL减少可能是由于联合治疗后基牙创伤去除，牙周炎症消除，牙周组织再生的结果。对照组基牙PD、CAL在0、3、6个月无统计学差异，提示由于前期的牙周基础治疗使得基牙炎症消除，且修复体安装后未对基牙造成牙周损伤，牙周骨组织也未进一步破坏、吸收，这是夹板治疗后基牙的牙周潜力调动的结果。

通过本研究，笔者积累了有关牙周病修复治疗的实践经验，为后续研究提供了宝贵的临床资料及数据，有利于进一步研究的深入。其次，牙周炎的治疗是系统性的，牙周炎伴牙列缺损的修复治疗则是口腔多学科密切配合方能顺利完成的，通过本研究，我们积累了多学科积极配合进行牙周系统治疗的经验，减少了患者的就诊次数，解决了患者的口腔难题，获得了患者的好评。

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(本文编辑张巧莲)

The preliminary analysis of the bacterial effect of main subgingival microbial on bone graft in combination with splint-like PFM bridge

WANG Yi1，HU Yang2，DU Jun1，HE Huiyu2

(1Department of Presthodontics, Traditional Chinese Medical Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China;2Department of Presthodontics, the First Affiliated Hospitai of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of main subgingival microbial flora in microbial bacteriology aspect by dynamic monitoring and quantitative analysis, before and after the bone graft in combination with splint-like PFM bridge treatment on conserving loosened distal abutment of Kennedy Ⅲ periodontic bone defect. Methods20 patients with the loosened distal abutment of Kennedy Ⅲ periodontic bone defect were divided into 2 groups. 10 patients loosened distal teeth were treated by bone graft in combination with splint-like PFM bridge in the treatment group, while the other 10 patients loosened distal teeth were treated with splint-like PFM bridge alone in the control group. Before and after treatment, the fluid of gingival sulous were collected and cultured during 24 hours, 4 weeks and 12 weeks. Porphyromonas gingivalis (Pg), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Fusobacterium ncleatum (Fn) and Preuotella intermedia (Pi) were detected by PCR. ResultsThe differences of colony count of the four subgingival microbial flora between the treatment group and the control group were not statistically significant; the differences of the base line of the value of PD and CAL between the two groups were also not statistically significant. PD and CAL values were reduced in the treatment group after 3 and 6 month. X-ray showed that all cases had no further alveolar bone absorption, and the amount of alveolar bone after treatment were increased with certain degree. ConclusionCompared with splint-like PFM bridge alone, the subgingival microbial flora of patients treated with bone graft in combination with splint-like PFM bridge were declined obviously. In comparison of bacterial analysis between treatment group and control group, we found that bone graft in combination with splint-like PFM bridge could promote the reconstruction of periodontal tissue of loosened distal teeth.

Keywords:bone graft; splint-like PFM bridge; subgingival bacteria

基金项目：乌鲁木齐市科学技术计划项目(Y09131002)

作者简介：王毅(1982-)，男，住院医师，研究方向：口腔修复及种植治疗。 通信作者：何惠宇，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：口腔修复及种植，E-mail：wangyi_wy007@163.com。

中图分类号：R78

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)07-0879-06

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.07.017

[收稿日期：2015-12-27]