胃癌组织中miRNA-21和miRNA-34的表达及其意义

许新才, 林　海, 张　旺 , 张文斌

(新疆医科大学第一附属医院消化血管外科中心，乌鲁木齐　830054)

胃癌组织中miRNA-21和miRNA-34的表达及其意义

许新才1, 林海, 张旺 , 张文斌

(新疆医科大学第一附属医院消化血管外科中心，乌鲁木齐830054)

摘要：目的探讨微小 RNA(microRNA，miRNA)miR-21 和miR-34在胃癌组织(T)和癌旁正常胃黏膜组织(N)中的表达及其临床意义。 方法运用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(PCR)测定 T和N中的 miR-21、miR-34表达水平。结果(1)T中miR-21 、miR-34的表达量分别为(8.32±4.48)和(3.40±0.49)，N中两者表达量分别为(4.13±1.29)和(3.86±0.51)，T中miR-21的水平明显高于N ，miR-34的水平明显低于N，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)T中miR-21水平与TNM 分期、淋巴结转移有关(P<0.05) ；T中miR-34表达量与肿瘤大小、组织学分级、TNM 分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。结论胃癌组织中miR-21的升高和miR-34的下降在胃癌发生、发展中起着重要作用，提示肿瘤的淋巴结转移、侵袭性、远处转移增强。

关键词：胃癌； miR-21； miR-34

胃癌是人类常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤第二位[1]，我国为胃癌高发区,胃癌患病率和死亡率是世界平均水平的2倍多，死亡率居恶性肿瘤之首[2]。胃癌的发生、发展是一个多因素、多基因作用的复杂过程，近年来研究发现微小 RNA( microRNA, miRNA) 与肿瘤密切相关，其以原癌基因、抑癌基因的方式发挥作用。随着分子生物技术的发展，同肿瘤有关的微小RNA陆续被人们发现。有研究显示miRNA-21、miR-34在多种消化道肿瘤中表达异常，参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移[3]。本研究旨在探讨癌旁正常胃黏膜组织同胃癌组织中的miR-21、miR-34表达及其与临床病理因素的关系。

1材料与方法

1.1临床资料收集新疆医科大学第一附属医院重大疾病资源样本库中人胃腺癌组织(T)和距肿瘤>5 cm的癌旁正常胃黏膜组织(N)标本各75例，其中男性50例，女性25例，年龄29～81岁，中位年龄64.6岁 ；汉族55例，少数民族20例(其中维吾尔族15例，回族1例，蒙古族1例，锡伯族1例，哈萨克族2例)；高分化腺癌2例，中分化腺癌44例，低分化腺癌29例；淋巴结转移44例，未转移31例；所有病例均有详细的临床病理资料，每个标本均经病理学诊断确诊。根椐2003年美国肿瘤联合会(AJCC) 和国际抗癌联盟( UICC) 联合制定的TNM分期标准进行临床分期：TNMⅠ、Ⅱ期32例，TNM Ⅲ、Ⅳ期43例。患者手术前均未进行放疗、化疗、生物治疗等其他治疗。将所有标本剪成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小数块，立即置 RNA 保存液中，于-80℃ 冰箱保存备用。见表1。

1.2实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)检测按TRIzol 说明书抽提GC组织中的总 RNA。 分别测定 RNA 在分光光度计波长 280 nm 和 260 nm 的吸收值，计算浓度并评估纯度。 按试剂说明书测定 miR-21、miR-34水平, 以 U6snRNA 为内参照,实验重复 3 次，取平均值。依据所得 Ct 值，采用相对定量法 2-ΔCt分别计算被检组织中miR-21、miR-34水平,RE=2-ΔCt，△Ct=[肿瘤(CtmiRNA-21-CtU6)]-[正常对照组织(CtmiRNA-21-CtU6)]，RE代表miRNA-21在肿瘤组织的相对表达,即肿瘤组织中的表达量与配对正常组织中的表达量的比值。

1.3统计学方法采用 SPSS17.0 统计软件进行统计学分析；数据比较用方差分析和计量资料的配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1T、N中miR-21、miR-34表达水平的比较T中miRNA-21的相对表达量高于N中miRNA-21的相对表达量，差异有统计学意义(P<0.05)；T中miRNA-34的相对表达量低于N中miRNA-34的相对表达量，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　T和N中miRNA-21、miRNA34表达水平比较

2.2 T中miR-21、miR-34的表达与临床病理因素的关系T中miRNA-21的相对表达量与患者性别、年龄、民族、肿瘤大小和组织学分级，差异均无统计学意义(P均>0.05)；T中miRNA-21的相对表达量与TNM分期及淋巴结转移明显相关(P<0.05)，且随TNM分期增高和淋巴结转移相对表达量上调。T中miRNA-34的相对表达量与患者性别、年龄、民族差异均无统计学意义(P均>0.05)；T中miRNA-34的相对表达量与肿瘤大小、组织学分级、TNM分期及淋巴结转移明显相关(P<0.05)，且随肿瘤体积增大、组织学分级增高、TNM分期增高和淋巴结转移相对表达量降低(表2)。

临床因素nmiRNA212-ΔCtP值miRNA342-ΔCtP值年龄/岁 ≥60547.63±5.050.0623.62±0.580.073 <60217.32±4.960.0543.50±0.690.060性别 男性348.31±3.320.0663.43±0.480.091 女性418.27±2.750.0953.37±0.430.154民族 汉族557.61±4.160.0722.98±0.680.097 少数民族207.95±3.580.0652.94±0.700.150大小/cm <5118.50±0.340.0633.50±0.560.081 ≥5648.36±0.550.0783.16±0.470.057组织学分级 高分化287.42±4.120.0753.53±0.340.150 中分化357.95±5.230.0853.23±0.450.067 低分化128.16±3.290.0913.05±0.370.055TNM分期 T1+T2457.03±1.340.0313.36±0.420.048 T3+T4309.53±4.070.0022.26±0.370.041淋巴结转移 有309.65±4.950.0212.39±0.550.019 无458.03±2.520.0333.36±0.570.039

3讨论

近年来，随着基础医学、分子生物学的不断发展，肿瘤发生机制研究取得很大进步。研究发现miRNA广泛存在于多种生物中，约占整个基因组基因总数的2%[3]。miRNA 能通过与靶 mRNA 特异性碱基互补配对引起靶 mRNA 降解或抑制其翻译，达到调控基因表达的目的[4]。miRNA已被证实参与和调控了包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程，肿瘤与miRNA的关系引起了人们的高度重视。 miR-21 是人类较早发现、广泛存在的 microRNA，在多种肿瘤组织和细胞中过表达，包括胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、肝癌、大肠癌、胶质瘤和胆管癌等，因此miRNA-21是一个公认的致癌性miRNA[5-6]。miR-21 通过对靶基因PTEN、PDCD4、maspin、TPM1、caspase-3/7/9、p53、bcl-2 等的调控参与肿瘤的生长、侵袭、转移和耐药。本研究显示T中miR-21相对表达量(8.32±4.48)高于N中相对表达量(4.13±1.29)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示T中miR-21升高在肿瘤的发生和发展过程中起一定的作用。Chan 等[7]用PCR检测37例胃癌组织和正常组织miR-21水平，结果92%胃癌组织中miR-21过表达，认为miR-21可以作为胃癌诊断的有效标志物，与本研究结果一致。本研究显示T中miR-21相对表达量与TNM 分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05)，可能是miR-21作用于靶基因，使靶基因在肿瘤组织中的表达缺失或低表达，失去抑癌基因的作用，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、侵袭和转移[8]。Zhang 等[9]研究发现，胃癌株过表达miR-21其增殖性和侵袭性强，抑制 miR-21 的表达后细胞株的增殖性和侵袭性降低。Meng等[10]也观察到在肝癌细胞中有此现象。

miR-34最先发现于线虫，其编码一段保守的miRNA，分为3个同源基因即miR-34a、miR-34b、miR-34[11],miR-34被认为是“抑癌基因”，可被p53激活，抑制细胞生长，调节细胞周期，诱导细胞调亡。miR-34家族启动子均位于CpG岛，miR-34家族的表达均受DNA甲基化调控。在前列腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中，均可见miR-34a启动子区高甲基化可以下调成熟的miR-34a的表达水平[12-13]。本研究显示T中miR-34相对表达量(3.40±0.49)低于N中相对表达量(3.86±0.51)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示T中miR-34下降在肿瘤的发生、发展过程中起一定的作用。Tazawa等[14]研究证实在人类结肠癌的发展过程中存在miR-34a的下调；本研究T中miR-34相对表达量与TNM 分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05)，可能提示miR-34的下调，失去抑癌作用。Bommer等[15]对肺癌的研究也发现，miR-34家族的表达可降低非小细胞型肺癌的发生和抑制其肿瘤细胞的生长。目前研究显示，miR-34家族参与的细胞调亡及细胞周期调控主要通过以下几个途径产生：(1)miR-34与 BCL-2途径；(2)miR-34与E2F家族途径；(3)miR-34-Cyclin/CDK-pRb 途径。Ji[16]等通过对p53缺失的Kato III胃癌细胞研究，推测miR-34可能具有逆转野生型p53基因的功能；p53缺陷的胃癌细胞,重建功能性miR-34能抑制细胞增长,诱导凋亡。表明miR-34可能具有恢复p53基因的功能。恢复miR-34可能为p53基因缺陷型胃癌提供新的分子靶向治疗方案。

综上所述，胃癌常有多种miRNA的表达异常。本研究已明确胃癌组织中miR-21和miR-34表达水平异常。miR-21表达与TNM分期、淋巴结转移关系密切；miR-34表达与肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、淋巴结转移关系密切。重建功能性miR-34可能恢复p53基因功能，能诱导化学敏感及凋亡，抑制细胞增长,这些为胃癌的治疗提供了线索。在后续研究中将进一步探讨miR-21和miR-34作用机制及调控网络。

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(本文编辑周芳)

Expression of miRNA-21 and miRNA-34 in gastric carcinoma and clinical significance

XU Xincai, LIN Hai, ZHANG Wang, ZHANG Wenbin

(Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054, China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of micro RNA (microRNA, miRNA) miR-34 and -21 in gastric tumor (T) and adjacent normal gastric mucosa (N) and clinical significance. MethodsMiR-21 and miR-34 levels in T and N were measured by real-time fluorescence quantitative PCR. Results(1)The levels of miR-21 in T and N were (8.32±4.48) and (4.13±1.29) (P<0.05) and the levels of miR-34 in T and N were (3.40±0.49) and (3.86±0.51) (P<0.05); (2) The level of miR-21 in T was related to TNM stage and lymphatic metastasis (P<0.05), while the level of miR-34 in T was related to tumor size, histological grade, TNM stage, lymphatic metastasis (P<0.05). ConclusionThe increase of miR-21 and the decrease of miR-34 in gastric tumor played an important role in the occurrence and development of gastric tumor, which were suggested that the lymphatic metastasis, invasion and distant metastasis of the tumor were enhanced.

Keywords:gastric tumor; miR-21; miR-34

基金项目：新疆医科大学研究生科研创新项目 (XJGR12013080)

作者简介：许新才(1979-)，男，博士，副主任医师，研究方向：胃肠肿瘤方向。 通信作者：张文斌，男，主任医师，硕士生导师，研究方向：胃肠肿瘤方向,E-mail: ZWB3216@sina.com。

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)07-0854-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.07.010

[收稿日期：2016-02-28]