川芎嗪联合运动训练对急性脑梗死模型大鼠星形胶质细胞与突触和运动功能的影响

闫春生

(黄河科技学院，河南　郑州　450063)

川芎嗪联合运动训练对急性脑梗死模型大鼠星形胶质细胞与突触和运动功能的影响

闫春生

(黄河科技学院，河南郑州450063)

〔摘要〕目的探讨川芎嗪联合运动训练对急性脑梗死大鼠星形胶质细胞、突触、运功功能的影响。方法将120只成功造模急性脑梗死大鼠随机分为空白组、运动训练组(运动组)、川芎嗪注射组(川芎嗪组)和川芎嗪联合运动训练组(联合组)。于术后1、3、6 w采用显微电镜观察法计数四组大鼠病灶周围星形胶质细胞和突触数量；采用免疫组化法测定四组大鼠病灶周围胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长相关蛋白(GAP)-43和突触素的含量；采用横木行走试验评价四组大鼠运动功能的恢复状况。结果运动组、川芎嗪组和联合组3个时间点的星形胶质细胞和突触数量均逐步增加，且均多于同时间点的空白组，但联合组的数量明显多于另外两组(P<0.05)；运动组、川芎嗪组和联合组3个时间点GFAP、GAP-43和突触素的含量均高于同时间点的空白组，但联合组的含量明显多于另外两组(P<0.05)；运动组、川芎嗪组和联合组3个时间点的运动功能评价得分均逐步上升，且均多于同时间点的空白组，但联合组的得分明显高于另外两组(P<0.05)。结论采用川芎嗪联合运动训练对急性脑梗死大鼠进行治疗，可以帮助促进大鼠星形胶质细胞和突触的增加和运动功能的恢复，且其效果好于进行单纯运动训练和川芎嗪注射治疗的大鼠。

〔关键词〕川芎嗪;运动训练;急性脑梗死;星形胶质细胞

星形胶质细胞的增生对于脑组织神经功能的恢复至关重要〔1〕。虽然目前对于这种损伤修复反应的触发机制尚不明确，但是可以通过监测病灶附近星形胶质细胞和突触的数目大致推断脑组织神经功能的恢复状况〔2〕。目前公认的对于脑组织功能恢复有积极作用的是运动训练，中药川芎嗪有改善脑部血液微循环、活血化瘀的功效〔3〕。本研究旨在探讨川芎嗪联合运动训练对急性脑梗死大鼠星形胶质细胞、突触、运功功能的影响。

1材料与方法

1.1实验动物选择一级雄性SD大鼠240只，月龄2.5～4个月，体重为(200±20)g，由江苏南京青龙场实验动物饲养中心提供。所有大鼠在研究期间均饲养于20℃～25℃条件下，给予普通颗粒饲料和自来水。本研究首先造成大鼠肾性高血压模型，造模成功每周检测大鼠血压，直到10 w后，大鼠血压基本稳定在(190±5)mmHg时，制作急性脑梗死大鼠模型。采用线栓法造成大鼠右侧大脑中间动脉闭塞。大鼠急性脑梗死造模成功的标志为大鼠在麻醉苏醒后24 h内出现以下症状〔4〕：①身体向左倾倒或向左转圈；②左侧躯体对疼痛刺激无反应；③提尾悬空时左前肢前伸现象消失。判定为造模成功。对于由于各种因素出现的造模失败造成试验动物数量不足时，通过随机抽样造模补齐。依据随机分组原则，将240只造模成功的大鼠分为空白对照组(空白组)、运动训练组(运动组)、川芎嗪注射组(川芎嗪组)和川芎嗪联合运动训练组(联合组)，每组60只。四组大鼠造模前血压、月龄、体重等基本资料均无统计学差异，有可比性。于造模后1、3和6 w 3个时间点，每次取20只大鼠，观察其相应生理指标和运动功能。

1.2仪器与试剂仪器：飞纳高分别率专业电镜，复纳科学仪器(上海)有限公司；动态颗粒图像分析仪，德国新帕泰克有限公司。试剂：注射用磷酸川芎嗪，化学药品，50 mg，海南双成药业股份有限公司；戊巴比妥钠，化学药品，5 g，北京普博斯生物；多聚甲醛，化学试剂，500 g，郑州亿之中化工产品有限公司；抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗、抗生长相关蛋白(GAP)-43单抗、兔抗人突触素抗体，北京中杉生物技术有效公司。

1.3运动训练和给药方式

1.3.1运动训练方式运动组和联合组大鼠每天进行行走、旋转和抓握力训练各10 min，1次/d。行走训练采用自制的150 cm长，2 cm宽，距地面10 cm的木板，将大鼠置于其上行走；旋转训练采用自制的100 cm长，30 cm半径的网状滚筒式训练器，该训练器被均分为4格，每次可以训练4只大鼠，训练器内置马达，训练时设置为5 r/min；抓握力训练采用1 cm×1 cm大小网格的网带，将大鼠置于其上后，突然将其垂立，每次保持10 s，注意观察大鼠是否会掉落。

1.3.2给药方式川芎嗪组和联合组大鼠接受川芎嗪注射液尾静脉注射。与造模成功24 h后，尾静脉注射川芎嗪葡萄糖溶液，剂量为9.6 mg/kg，1次/d，以2 w为1个疗程。

1.4观察指标

1.4.1显微电镜观察四组大鼠在造模成功后1、3、6 w分别取10只大鼠制作其脑组织冠状切片，每片厚度为2 mm，从包含梗死病灶的切片上取下病灶附近的脑组织1 mm3，将其按照标准步骤固定、染色，而后置于显微电镜下观察8 000倍视野下的神经胶质细胞和突触数量，选择20个视野计算神经胶质细胞和突触的平均数量。

1.4.2免疫组化研究四组大鼠在造模成功后1、3和6 w分别取10只大鼠测定其病灶附近脑组织中GFAP、GAP-43和突触素的含量：先经腹腔注射1%的戊巴比妥钠，而后经升主动脉插管后前后注入100 ml生理盐水和4%多聚甲醛。2 h后，取脑，制成5 μm的3套连续的贴胶切片。分别使用抗GFAP、GAP-43单抗和兔抗人突触素抗体对3套切片进行染色。在梗死病灶附近随机选择5个视野，使用图像分析系统检测免疫反应产物的信号密度值，以此来代表相应蛋白的含量。

1.4.3横木行走试验采用自制的150 cm长、2 cm宽、距地面10 cm的木板，将大鼠置于其上行走，木板一端给予强光照射和噪音刺激，另一端给予黑鼠笼。评分以患肢在行走中所起作用大小为依据，患肢起到0%的作用计1分，起到10%作用计2分，……，起到50%作用计6分，起到50%以上的作用计7分。评分由三人同时进行，取平均分，评分三人均不知大鼠分组情况。

1.5统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验。

2结果

2.1显微电镜观察结果四组大鼠随时间推移星形胶质细胞和突触数量都有所增加，但是运动组、川芎嗪组和联合组星形胶质细胞和突触数量增加的量都显著大于空白组(P<0.05)，其中联合组大鼠星形胶质细胞和突触数量增加的最为明显(P<0.05)。见表1。

表1　四组大鼠显微电镜观察结果,个/8 000倍视野，n=10)

与空白组比较：1)P<0.05；与运动组比较：2)P<0.05；与川芎嗪组比较：3)P<0.05；下表同

2.2横木行走试验结果四组大鼠随时间推移运动功能都有所恢复，但是运动组、川嗪组和联合组3种蛋白运动功能得分显著高于空白组(P<0.05)，其中联合组大鼠运动功能得分最为突出(P<0.05)。见表2。

2.3免疫组化研究结果四组大鼠随时间推移GFAP、GAP-43和突触素的含量都有所增加，但是运动组、川芎嗪组和联合组3种蛋白含量增加的量都显著大于空白组(P<0.05)，其中联合组大鼠3种蛋白含量增加的最为明显(P<0.05)。见表3。

表2　四组大鼠横木行走试验结果±s,n=20，分)

表3　四组大鼠免疫组化研究结果±s,n=10)

3讨论

本研究提示当机体发生急性脑梗死反应后，梗死部位周围的星形胶质细胞和神经连接仍然完整，且脑梗死会触发病灶周围的星形胶质细胞增生，重建神经传导连接。这一观点也可以从空白组大鼠在第1、3及6周末的脑切片电镜观察中发现其星形胶质细胞和突触数目逐渐增加这一实验现象加以印证。由此可见，这种本身即存在的星形胶质细胞和突触再生机制是脑梗死后运动功能恢复的基础。突触素的含量多少与突触的功能恢复密切相关。由此可以推测，早期的运动训练可以有效帮助病灶区域附近的星形胶质细胞增生和突触的产生，这一推论也和其他许多研究相符合〔4,5〕。方南燕等〔6〕研究指出早期的运动训练对星形胶质细胞增生有益。川芎嗪可以透过血脑屏障，具有活血化瘀，防止血小板凝结之功效，同时它还可以防止动脉粥样硬化的发生，具体改善病灶区域微循环的作用。根据研究结果推测，改善病灶区域微循环也有利于星形胶质细胞和突触的增生。此外，配合两种方法可以同时促进星形胶质细胞和突触的增生，且效果比单独使用一种方法更好。GAP-43是一种神经特异性的蛋白质，参与神经细胞的再生过程〔7〕。在神经元发育和再生过程中以高水平表达，可以帮助调解轴突延伸作用，同时还可以改变神经细胞形态〔8〕。但是本研究说明，病灶周围神经传导的重建可以不是以神经元的再生为主导的。

4参考文献

1Famakin BM.The immune response to acute focal cerebral ischemia and associated post-stroke immunodepression:a focused review〔J〕.Aging Dis,2014;5(5):307-26.

2Del Zoppo GJ.Plasminogen activators and ischemic stroke:conditions for acute delivery〔J〕.Sem Thromb Hemost,2013;39(4):406-25.

3王艺东,邱宇,潘经锐,等.大鼠脑梗死后乏氧组织长时间存在与星形胶质细胞的关系〔J〕.中华神经医学杂志,2009;8(8):781-4.

4谭来勋,孙圣刚,张双国,等.运动训练诱发大鼠脑梗死周边区域神经突触变化的机制〔J〕.中华物理医学与康复杂志,2006;28(7):433-6.

5肖胜军,张小玲,郭芳,等.蒙古沙鼠一过性脑缺血模型迟发性脑梗死的病理学特点〔J〕.中华神经科杂志,2012;45(2):124-8.

6方燕南,王雪晶,洪华,等.电刺激促进脑梗死大鼠星形胶质细胞与神经元可塑性的重建〔J〕.中国临床康复,2005;9(37):129-31.

7王德生,戚基萍,李光伟,等.人脑梗死后星形胶质细胞反应和微血管标记物相关性的研究〔J〕.中华老年医学杂志,2006;25(5):343-5.

8方燕南,黄海威,林健雯,等.星形细胞活性及GFAP在评价脑梗死中的作用及意义〔J〕.中国病理生理杂志,2002;18(6):643-5.

〔2015-07-21修回〕

(编辑李相军/滕欣航)

〔中图分类号〕R743

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2356-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.019

第一作者：闫春生(1972-)，男，硕士，讲师，主要从事基础医学研究。