PTEN在心肌缺血预适应和后适应中的调控作用

沈淑文　李春梅　张兴华

(山东大学附属省立医院心内科，山东　济南　250014)

PTEN在心肌缺血预适应和后适应中的调控作用

沈淑文李春梅张兴华

(山东大学附属省立医院心内科，山东济南250014)

〔摘要〕目的探讨人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)/Akt信号通路在心肌缺血预适应和后适应中的作用。方法雄性SD大鼠60只，随机分为4组：假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血预适应组(Ipre组)及缺血后适应组(Ipost组)。建立动物模型，实验结束后，计算心肌梗死面积，测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性，检测缺血心肌PTEN mRNA和蛋白含量及p-Akt蛋白表达水平。结果与IR组比较，Ipre组和Ipost组的心肌梗死面积明显缩小，CK、LDH的活性降低，PTEN mRNA和蛋白的含量降低，p-Akt蛋白的水平升高(P<0.05)。结论PTEN/Akt信号通路在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，心肌缺血预适应和后适应通过调节PTEN/Akt信号通路的表达在缺血再灌注损伤中发挥保护心肌的作用。

〔关键词〕PTEN；缺血再灌注损伤；预适应；后适应；Akt

心肌缺血预适应和缺血后适应可以减少心肌缺血再灌注损伤〔1～3〕，但其机制尚未完全阐明。PTEN是1997年Li等〔4〕在人体新发现的一种抑癌基因，它与细胞的生长、分化、凋亡调控密切相关。以往对PTEN的研究大多侧重于肿瘤方面，近些年发现PTEN/Akt信号通路在心肌重构〔5〕、心肌缺血再灌注损伤〔6〕等方面也发挥着重要的作用。应用特异性药物抑制PTEN的活性可缩小心肌梗死后心肌梗死面积，改善心功能〔7〕。因此我们推测，PTEN可能通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信号通路调控参与心肌缺血预适应和后适应的心脏保护作用，基于此本研究拟构建SD大鼠心肌缺血假手术、缺血再灌注、缺血预适应及缺血后适应动物模型，通过观察PTEN其下游信号分子的改变，明确PTEN/Akt信号通路在心肌缺血再灌注损伤中的作用。

1材料与方法

1.1实验动物与试剂雄性SD大鼠60只，体重(300±20)g，由山东中医药大学动物实验中心提供〔生产许可证号：SCXK(鲁)20110003〕。肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒：南京建成生物研究所；小鼠抗β-actin单抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗小鼠IgG：北京中杉金桥生物科技公司；PTEN兔单抗、p-Akt(Ser473)兔单抗：美国Cell Signaling Technology(CST)公司；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、Real Time PCR反应试剂盒：TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1动物模型分组及制备雄性SD大鼠60只，随机分为4组，每组15只。假手术(sham)组：左冠状动脉前降支仅穿线不结；缺血再灌注(IR)组：结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注180 min；缺血预适应(Ipre)组：结扎左冠状动脉前降支5 min、灌注5 min，反复3次后，结扎30 min再灌注180 min；缺血后适应(Ipost)组：结扎左冠状动脉前降支30 min后，灌注30 s、结扎30 s，反复3次，再灌注180 min。造模结束时，每组随机选取6只，做伊文思蓝、TTC染色，用于缺血及梗死范围的测定；其余9只用于血清心肌酶谱、PTEN mRNA和蛋白及p-Akt蛋白的检测。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠后，将其仰卧位固定于手术台上，将心电图机电极置于大鼠四肢皮下，观察并记录心电图变化。颈部和胸部备皮，用医用酒精消毒，气管插管，连接小型动物呼吸机，呼吸频率70次/min，潮气量7.5，呼气：吸气为1∶1，静观5 min，待大鼠呼吸平稳后开胸。沿剑突到左腋下线剪开约3 cm皮肤，逐层分离胸肌，剪开胸骨左缘3-4肋间的肋间肌，用眼睑撑开器撑开肋骨，剪开心包膜，充分暴露心脏，寻找左冠状动脉前降支，在左心耳和肺动脉圆锥处结扎血管。达到缺血时间时松开结扎线恢复血流。缺血成功标志：心电图示ST段抬高，心尖处可见心肌发白、水肿明显，心尖搏动减弱。再灌注成功标志：再灌注后，抬高的ST段逐渐回落，缺血心肌逐渐恢复正常心肌颜色。

1.2.2血清心肌酶谱CK、LDH的测定分别于缺血前、再灌注结束后，锁骨下静脉采血，将血样室温静置1 h，3 500 r/min离心10 min，收集血清。用酶标仪测定血清CK和LDH水平。

1.2.3心肌缺血及梗死范围的测定再灌注结果后，需要做做伊文思蓝、TTC染色的大鼠，在原位结扎左冠状动脉前降支，将2～3 ml 1%伊文思蓝沿心尖注入，待耳朵眼睛变蓝后停止，摘取心肌，用生理盐水洗干净，见非缺血区的心肌被染成蓝色后，缺血区未被染成蓝色，去除左右心耳、右室，游离左室，将左室置于-20℃冰箱中冰冻30 min，将心脏切成厚约2 mm的切片，再将切片心肌置于1%的TTC磷酸缓冲液中37℃孵育15 min，可见缺血并梗死区为灰白色，缺血未梗死区呈深红色，非缺血区为蓝色，置于4%中性甲醛中固定过夜后，仔细分离这3种颜色心肌，并称重。缺血区面积以缺血区心肌重量占左心室重量百分比来表示，梗死区面积以梗死区心肌重量占缺血区心肌重量百分比表示。

1.2.4RT-PCR检测心肌PTEN mRNA的表达水平实验结束后，摘除心肌，sham组切取左心室心肌(此为正常心肌)，其余三组切取缺血部分心肌，每组各取100 mg心肌组织，用生理盐水冲洗干净，用Trizol试剂盒，按试剂盒说明书提取RNA，测定RNA浓度和纯度，取1 μg RNA逆转录成cDNA。引物序列如下：①目的基因PTEN上游引物序列：5'CCAATGGCTAAGTGAAGACGACAA3'；下游引物序列：5'CATAGCGCCTCTGACTGGGAATA3'。②内参基因β-actin上游引物：5'GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3'；下游引物：5'GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3'，每个样本做2个复孔并按RT-PCR试剂盒说明进行上机反应。

1.2.5Western 印迹法检测心肌中PTEN、p-Akt表达水平每组各取100 mg心肌组织，加入300 μl含有1%PMSF和1%磷酸酶抑制剂的裂解液，震荡混匀后冰上静置20 min。超声充分裂解后，4℃离心机，20 000 r/min，离心30 min，留取上清液。检测提取的心肌组织蛋白浓度，并分别定量上样，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，牛奶封闭1 h，一抗4℃过夜，二抗室温孵育1 h，用ECL发光液显色。

1.3统计学方法应用SPSS17.0行单因素方差分析。

2结果

2.1血清心肌酶谱CK、LDH的测定缺血前各组血清CK、LDH无统计学差异(P>0.05)；再灌注180 min末，IR组、Ipre组、Ipost组血清CK、LDH水平较sham组明显升高(P<0.05)；Ipre组、Ipost组血清CK、LDH水平均显著低于IR组(P<0.05)，此时这两组间无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2心肌缺血及梗死范围sham组心肌无明显缺血；余各组因左前降支结扎所致心肌缺血面积无差异(P>0.05)；Ipre组、Ipost组的心肌梗死面积较IR组明显缩小(P<0.05)。Ipre组、Ipost组无差异(P>0.05)。见表2。

表1　各组大鼠血清心肌酶谱含量比较

与sham组比较：1)P<0.05；与IR组比较：2)P<0.05，表3同

表2　各组大鼠心肌缺血及梗死面积比较±s，n=6，%)

与IR组比较：1)P<0.05

2.3RT-PCR法检测心肌PTEN mRNA的表达变化采用2-△△CT的方法分析各组心肌PTEN mRNA的表达水平。与sham组(1.00±0.21)比较，IR组(2.05±0.59)、Ipre组(1.62±0.27)和Ipost组(1.57±0.34)PTEN mRNA明显升高(P<0.05)；与IR组比较，Ipre组、Ipost组的PTEN mRNA明显降低(P<0.05)，且Ipre组、Ipost组两组间无差异(P>0.05)。

2.4Western 印迹法检测心肌中PTEN、p-Akt蛋白表达水平与sham组比较，IR组、Ipre组和Ipost组PTEN、p-Akt蛋白表达明显升高(P<0.05)；与IR组比较，Ipre组、Ipost组的PTEN蛋白表达明显降低(P<0.05)，p-Akt蛋白明显升高(P<0.05)，且两组间无差异(P>0.05)。见图1。见表3。

表3　各组大鼠心肌PTEN、p-Akt蛋白表达的

图1　各组大鼠心肌PTEN、p-Akt蛋白表达水平

3讨论

心肌缺血再灌注损伤是指在一定条件下恢复缺血心肌血液供应后，不仅不能使组织、器官功能恢复反而加重组织器官功能障碍和结构损伤。缺血再灌注损伤严重影响再灌注的疗效。因此降低再灌注损伤，提高疗效成为急性心肌梗死治疗的重点。本研究提示心肌缺血预适应和后适应可通过调节PTEN/Akt信号通路，在缺血再灌注损伤中发挥保护心肌的作用。PI3K/Akt信号通路是心肌缺血再灌注中主要的促生存通路〔6〕。Akt是PI3K信号通路最重要的下游信号蛋白，PTEN可以拮抗PI3K，抑制Akt的活性。本研究提示PTEN/Akt信号通路在心肌缺血再灌注损伤中被激活，PTEN/Akt信号通路可能在心肌缺血再灌注损伤分子机制中发挥重要作用；缺血预适应、后适应降低了PTEN的基因水平及蛋白水平的表达，提高了p-Akt的水平，减轻心肌缺血再灌注损伤。这种保护作用可能与抑制PTEN，激活PI3K/Akt通路有关。活化的Akt能够作用于下游的靶点，激活抗凋亡蛋白如：p70s6k、eNos、bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白如：GSk-3β、bad、caspase9的表达从而减轻心肌损伤〔6，7〕。由此推断PTEN在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。Keyes等〔8〕在大鼠心肌缺血再灌注模型中应用PTEN抑制剂，发现PTEN抑制剂可以减少细胞死亡改善心功能。Ruan等〔9〕和Zu等〔10〕发现在PTEN基因敲除小鼠的心肌缺血再灌注模型中，心肌存活率较野生型增加。Parajuli等〔5〕利用腺病毒转染PTEN基因，建立心肌梗死模型发现PTEN的高表达增加心肌梗死后心肌细胞的凋亡。这些研究证明了抑制PTEN的表达可以保护心肌，上调PTEN的表达增加心肌坏死。本研究提示预适应、后适应对心脏的保护作用可能是通过抑制PTEN的表达发挥作用。目前对PTEN的研究还有很多未明，就本研究及国外其他研究〔7,9,10〕所知抑制PTEN的表达对心肌缺血再灌注有保护作用，但长期抑制PTEN的表达可导致肿瘤和心肌肥厚、心力衰竭、心肌纤维化等疾病〔11，12〕。虽有研究〔7〕表明短时间的PTEN抑制近期未引起心肌肥厚，但其远期影响，作用时间有待进一步解决。

4参考文献

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〔2014-10-19修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目(No.2009QW015)；山东省科技攻关计划资助项目(No.2007GG20002045)

通讯作者：张兴华(1956-)，男，主任医师，博士生导师，主要从事心血管疾病研究。

〔中图分类号〕R541.4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2334-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.010

第一作者：沈淑文(1987-)，女，硕士，主要从事心血管疾病研究。