雌二醇对去势大鼠局灶性脑缺血后小窝蛋白-1和血管内皮生长因子表达的影响

2016-06-29刘柏炎宋晓玲陈雪梅

中国老年学杂志 2016年10期

关键词：去势局灶雌二醇

刘柏炎　宋晓玲　易　健　陈雪梅

(湖南中医药大学，湖南　长沙　410007)

雌二醇对去势大鼠局灶性脑缺血后小窝蛋白-1和血管内皮生长因子表达的影响

刘柏炎宋晓玲易健陈雪梅

(湖南中医药大学，湖南长沙410007)

〔摘要〕目的探讨去雌二醇对去势大鼠局灶性脑缺血(MCAO)后小窝蛋白(caveolin)-1和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法60只雌性大鼠，切除卵巢复制去势模型，随后采用大脑中动脉线栓法复制MCAO模型，随机分组为假手术组、去势(OVX)模型组、脑缺血模型组(MCAO组)、去势后联合MCAO组(双模型组)和雌激素组，采用免疫组织化学法检测各组动物脑内caveolin-1、VEGF的表达，同时评价其神经功能。结果在正常大鼠脑内有一定量caveolin-1、VEGF阳性细胞，去势对其影响不明显，脑缺血后caveolin-1、VEGF阳性细胞增加，与MCAO组与双模型组比较，雌激素能改善模型大鼠的神经功能缺失症状，增强caveolin-1、VEGF的表达(P<0.05)。结论雌激素能增加去势大鼠局灶性脑缺血后caveolin-1、VEGF的表达，是其抗脑缺血的可能作用机制之一。

〔关键词〕雌激素；局灶性脑缺血；去势；caveolin-1；VEGF

脑卒中作为中老年常见的急性脑血管疾病，是致残致死的主要因素之一。临床流行病学发现缺血性脑卒中发病率存在男女性别差异，绝经前女性发病率低于同龄男性，绝经后其发病率较绝经前显著增加〔1,2〕。生理水平的雌激素治疗可降低卒中发生的相对危险度和死亡率〔3〕，但其作用机制尚未见完全明确。小离蛋白(caveolin)-1与血管内皮生长因子(VEGF)可能在脑缺血损伤和修复中扮演了重要作用〔4,5〕，本文拟从caveolin-1、VEGF角度探讨雌激素抗脑缺血的作用机制。

1材料与方法

1.1药物及主要试剂戊酸雌二醇片(补佳乐)购自拜耳医药保健有限公司广州分公司，麻油溶解为终浓度500 μg/ml，冷藏备用。小鼠抗大鼠 VEGF单克隆抗体、小鼠抗大鼠 caveolin-1抗体购自Abcam公司，SABC 免疫组化试剂盒、DAB显色剂购自Zymed公司。

1.2主要仪器德国 Leica 公司 RM2235石蜡切片机，日本olympus公司BX51光学显微镜及Image-Pro Express图像分析系统。

1.3动物分组与给药雌性特殊清洁级(SPF)Wistar大鼠，280～300 g，湖南中医药大学实验动物中心提供。大鼠随机分为去势模型组(OVX组)、脑缺血模型组(MCAO组)、去势后联合脑缺血组(双模型组)、雌激素组，动物局灶性脑缺血术后7 d处死，剔除死亡动物外每组12只；另设假手术组6只。根据文献〔6〕雌激素组口服给予戊酸雌二醇溶液500 μg·kg-1·d-1，其他各组动物均给予等体积无菌蒸馏水，自由饮食、活动。

1.4动物

1.4.1去势造模(OVX)参照文献〔6〕将60只大鼠10%水合氯醛(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉后，腹位固定，腋下2 cm切开腹腔，切除卵巢(假手术组只切除小块脂肪)，缝合术后予以抗感染处理。如法摘除另一侧的卵巢。手术后第5天开始每天取其阴道分泌物涂片，每天一次，连续5 d，以不出现动情周期反应确定造模成功。

1.4.2局灶性脑缺血(MCAO)造模参照文献改良Zea等〔7〕的大脑中动脉线栓法建立MCAO大鼠模型：10%水合氯醛(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉后，将去势雌鼠固定，颈正中切口游离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉部下方剪一小口，将一预先烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉，直到遇到轻微阻力为止，插入深度由分叉部计为(17～20)mm，固定尼龙线，依次关闭切口。假手术组仅切开皮肤、分离右侧颈总动脉后即缝合。动物苏醒后神经功能评分1～3分入者组。

1.5观察指标

1.5.1神经功能评分参照文献〔7〕方法进行5级评分。各组动物在手术后2 h和处死前2 h进行评分。

1.5.2红四氮唑(TTC)检测参照文献〔7〕将大鼠以10%水合氯醛(4.0 mg/kg)麻醉后，断头取脑，用0.01 mol/L PBS冲洗后立即放入-34℃冰箱快速冷冻30 min后去掉嗅球、小脑和低位脑干，自额极后2 mm做等距离5个冠状切片，脑片用2%浓度TTC染色，37℃避光水浴染色30 min，正常组织呈红色，梗死组织为白色。拍成数码照片拷入电脑，运用Image-Pro Express图像分析系统计算非梗死区面积，梗死面积的百分比(IS%)按Swanson方法〔8〕进行校正。IS%=(健侧总面积-患侧非梗死区面积)/2×健侧总面积×100%。

1.5.3VEGF、caveolin-1检测采用免疫组化SABC法检测，DAB显色，其中VEGF浓度为1∶300，caveolin-1浓度为1∶500。大鼠以10%水合氯醛(4.0 ml/kg)麻醉后，4℃的4%多聚甲醛经心脏灌注固定，冠状切片。每只动物取切片5张，置于100倍物镜下，每张切片随机选5个视野，用Olympus MicroImage 4.0 图像处理系统自动计数免疫阳性细胞数。

2结果

2.1雌二醇对大鼠脑缺血面积及神经功能的影响用药前MCAO组、双模型组、雌激素组神经功能缺失症状积分和缺血面积三组间无显著性差异，但与假手术组和OVX组比较差异显著(P<0.05)；治疗后雌激素组在改善神经功能缺失症状和减少脑缺血面积上与MCAO组、双模型组有显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1　补阳还五汤对大鼠脑缺血面积及

与MCAO组比较：1)P<0.05；与双模型组比较：2)P<0.05；与假手术组和OVX组比较：3)P<0.05

2.2雌二醇对模型大鼠VEGF、caveolin-1表达的影响在正常脑组织中VEGF、caveolin-1均有一定程度的表达，脑缺血后MCAO组、双模型组、雌激素组VEGF、caveolin-1表达增加，与假手术组、OVX组比较有显著性差异(P<0.05)，且雌激素组能明显增加VEGF、caveolin-1表达，与MCAO组、双模型组差异均有显著性(P<0.05)。见表2。

表2　补阳还五汤对大鼠缺血脑内caveolin-1、

与MCAO组比较：1)P<0.05；与双模型组比较：2)P<0.05

3讨论

脑血管阻塞后，缺血周围区组织由于血流的低灌注引起细胞的继发性损伤，因此，重建周围区微循环、恢复组织血流供应对功能康复有着重要的意义。

脑缺血后半暗区组织血运重建的好坏对患者功能恢复有显著影响〔9〕，而血管新生是血运重建的物质基础。血管新生包括内皮祖细胞增殖、移行、管腔形成和出芽等多个环节，受众多因素调节。VEGF作为一种特异性作用于血管内皮细胞的促有丝分裂原，在血管新生中起重要作用。当组织低氧、缺血时，VEGF表达增强并与其特异性受体结合而发挥生理作用。研究发现，VEGF过表达、低表达大鼠和VEGF野生型大鼠在脑缺血损伤后VEGF过表达大鼠脑梗死体积最小〔4〕。caveolin-1不仅是细胞质膜微囊的最主要结构组分，也是其功能蛋白，caveolin-1通过其脚手架结构域与eNOS、PKC等多种信号分子结合，调节信号转导过程，参与细胞的多种生理、病理活动〔5〕。研究表明，caveolin-1参与了脑缺血损伤和组织修复过程，如局灶性脑缺血后caveolin-1基因缺失小鼠脑水肿和梗死面积加重，神经功能恢复速度明显减缓〔10〕；抑制caveolin-1可抑制缺血周边脑组织的血管新生〔11〕。更有学者发现，caveolin-1能影响氧糖剥夺/复氧损伤的人脐带血内皮祖细胞中VEGF表达〔12〕，caveolin-1敲除小鼠脑缺血后，血管功能不能有效恢复，对VEGF的刺激无反应，血管新生减弱。本实验发现，脑缺血后VEGF和caveolin-1表达显著增加，去势可减少两者的表达，但仍高于假手术组；VEGF与Careolin-1表达规律相似，但cavedin-1表达强度明显弱于VEGF。可见，caveolin-1参与了VEGF信号转导通路。

雌激素作为类固醇类激素，已经证实与脑卒中的发生有密切关系〔1〕，研究发现去势大鼠脑缺血面积显著增加、神经功能缺损严重，给予雌二醇治疗可减少梗死面积，促进神经功能恢复〔13〕。目前认为其抗缺血损伤与改善血流供应、抗氧自由基损伤和抑制凋亡等有关〔14〕，但机制尚未完全明确。相关研究发现雌激素呈剂量依赖性地刺激培养的脑血管内皮细胞分泌VEGF和新血管形成〔15〕。生理浓度雌二醇在正常氧条件下促进体外视网膜毛细血管内皮细胞 VEGF表达，低氧条件下通则降低VEGF表达〔16〕。雌二醇还能促进血管平滑肌细胞caveolin-1基因表达〔17〕，通过调节caveolin-1表达而促进内皮祖细胞增殖〔18〕。本研究发现，雌激素治疗后神经功能缺损积分减少，且能显著增加careolin-1和VEGF的表达。

本实验首次证实，去势大鼠脑缺血损伤后caveolin-1与VEGF阳性细胞数少于单纯脑缺血大鼠，予以雌激素治疗后，动物神经功能恢复明显，caveolin-1与VEGF表达增强，提示影响VEGF及caveolin-1是雌激素抗脑缺血损伤的又一可能机制。

4参考文献

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