血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法的建立

杨超一　冯婷婷　张雪峰　卢金辉　王　斌

(原子高科股份有限公司，北京102413)

血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法的建立

杨超一冯婷婷张雪峰卢金辉王斌

(原子高科股份有限公司，北京102413)

[摘要]目的：建立人血管紧张素Ⅰ(Ang Ⅰ)化学发光免疫分析方法，通过测定血浆中血管紧张素Ⅰ的含量计算肾素活性。方法：用生物素标记Ang Ⅰ抗原，荧光素标记AngⅠ抗体，将抗荧光素抗体包被于化学发光板，以链亲和素酶为催化剂，采用竞争法建立Ang Ⅰ化学发光免疫分析方法。结果：本方法的测量范围为100～7 800 pg/ml，灵敏度为24.3 mU/ml，批内变异为5.6%～8.7%，批间变异为6.8%～10.4%，回收率为95.4%～105.3%，稀释实验测定值与理论值呈线性相关，相关系数为r=0.999。与放射免疫分析试剂盒的相关性方程分别为y=0.95x+235.70，相关系数r=0.973。包被板、生物素标记AngⅠ抗原以及荧光素标记AngⅠ抗体在37℃存放一周稳定性良好。结论：方法学鉴定结果符合免疫分析的基本要求。

[关键词]血管紧张素Ⅰ(Ang Ⅰ)；生物素；荧光素；链亲和素酶；化学发光免疫分析

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)是人体血压、水和电解质平衡的重要调节系统，对维持人体内环境的稳定起着十分重要的作用。肾素在生理和许多病理情况下，其数量和活性决定了整个体系的活性，因此测定肾素活性对判断RAAS活性是非常重要的。实际临床中肾素活性是通过人血浆中AngⅠ产生的速率测定的，即37℃条件下1 h肾素原被肾素催化转化为Ang Ⅰ的量。目前检测血浆中肾素活性、血管紧张素Ⅱ和醛固酮含量已经成为原发性和继发性高血压、原发性醛固酮增多症等疾病的诊断、治疗及研究的重要指标[1-5]。此外对一些相关慢性心力衰竭、肾病、肝硬化等疾病的诊断、治疗以及发病机理的探讨有着重要的临床意义[6-8]。

化学发光免疫分析技术是近十几年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术[9]，在实际应用中具有无放射性污染、较高灵敏度和特异性免疫反应、易普及推广等优点。本工作采用竞争法建立了血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器化学发光检测仪(1420 Multilabled Counter)为芬兰Wallac产品；伽玛计数器(GAMMA-C12)为美国DP公司产品。

1.1.2主要试剂荧光素、生物素、血管紧张素Ⅰ抗原为Sigma产品； 96孔化学发光板为Nunc产品；抗荧光素抗体为北京华信行科技有限公司产品；链亲和素酶为Xema产品；血管紧张素Ⅰ抗体、发光底物、放射免疫分析试剂盒均由原子高科股份有限公司提供。实验所用其他试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1标准品的配制用标准品稀释液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB溶液)将AngⅠ配制成0、100、250、625、1 560、3 900、7 800 pg/ml，然后以 1.0 ml/瓶分瓶冻装，-20℃保存，使用前用1.0 ml标准稀释液进行复溶。

1.2.2固相抗体的制备用0.05 mol/L pH9.5碳酸缓冲液(CB)稀释包被抗荧光素抗体至5 μg/ml，并加入发光板中(200 μl/孔)，置4℃ 过夜。次日，倒去包被液，拍干。每孔加入250 μl封闭液，37℃温育1 h。倒掉封闭液后自然晾干备用。

1.2.3生物素标记AngⅠ抗原的制备[10]首先用DMSO溶解生物素浓度为1 mg/ml，然后取100 μg生物素加入到200 μg AngⅠ抗原(溶于200 μl 0.5 mol/L的Na2HPO4溶液)中，混合摇匀，用0.02 mol/L的磷酸缓冲溶液(PB)透析3 d，取出后加入等量甘油置于-20℃保存。

1.2.4荧光素标记AngⅠ抗体的制备[11]首先用DMSO溶解荧光素为浓度10 mg/ml，然后取16 μg荧光素加入到200 μg AngⅠ抗体(溶于400 μl 0.1mol/L 的CB)中，摇匀混合后，室温避光搅拌4 h，再用0.02 mol/L的PB透析3 d，取出后加入等量甘油置于-20℃保存。

1.2.5化学发光免疫分析程序将100 μl标准品、血浆样品(一份4℃存放，一份37℃保温1 h)加入已包被好抗荧光素抗体的微孔板中；每孔中加入50 μl生物素标记的AngⅠ抗原和50 μl荧光素标记的AngⅠ抗体； 轻摇混匀，37℃下水浴2 h；倾去微孔中反应液，用稀释好的洗涤液洗涤5次(300 μl/孔)，拍干；每孔再加入200 μl链亲和素酶，37℃下水浴30 min；倾去微孔中反应液，洗涤。将发光底物A和B按1∶1(体积比)混匀(临用前新配)。然后分别向每个微孔中加入200 μl发光底物溶液，在发光测量仪上测量各孔的发光强度(cps)，测量时间0.1秒/孔。以标准品浓度为横坐标，以发光计数值为纵坐标，以Logit-log直线回归制作标准曲线。最后计算出：PRA(pg/ml/h)=37℃ 1 h条件AngⅠ浓度值-4℃条件AngⅠ浓度值。

2结果

2.1方法学优化

2.1.1生物素标记抗原工作浓度的选择用稀释液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB溶液)将生物素标记抗原浓度分别稀释为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100倍，观察不同生物素标记抗原浓度对免疫分析结果的影响。结果如表1所示。根据其曲线B/B0%和线性相关系数，选定生物素标记抗原工作浓度为1∶50。

2.1.2荧光素抗体浓度的选择用稀释液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB 溶液)将荧光素标记抗体浓度分别稀释为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，观察不同生物素标记抗原浓度对免疫分析结果的影响。结果如表2所示。根据其曲线B/B0%和线性相关系数，选定荧光素标记抗体工作浓度为1∶200。

2.2方法学鉴定

2.2.1标准曲线通过方法学建立，得到的血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法的标准曲线示于图1。标准曲线方程为y=-2.14x+6.75，r=0.999。

2.2.3精密度对3份含低、中、高不同浓度的血浆样品分别在一次实验中平行多孔测定和在不同实验中重复测定，得出PRA的平均值和SD以及变异系数，结果列于表3。本方法的批内变异系数为5.6%～8.7%，批间变异系数为6.8%～10.4%。可见本方法的精密度较好，符合免疫分析的要求。

表1生物素标记抗原浓度选择

Tab.1Selection of concentration in biotin labeled antigen

Dilution1∶101∶201∶501∶100B/B0%95%84%77%69%rvalue0.9950.9970.9990.996

表2荧光素标记抗体浓度选择

Tab.2Selection of concentration in fluoresce in labeled antibody

Dilution1∶501∶1001∶2001∶400B/B0%94%81%79%79%rvalue0.9960.9980.9990.995

图1　血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析标准曲线Fig.1　Standard curve of chemiluminescence immunoass-ay for AngⅠ

2.2.4健全性将一份高浓度血浆样品进行倍比稀释后测定，稀释度与测定值的线性相关曲线如图2所示。经计算测定值和稀释度的相关性方程为：y=3 642x+10.90，相关系数r=0.999。

2.2.5回收率将不同浓度的血管紧张素Ⅰ标准品分别以等体积加入到同一份血浆样品中测定，测定结果列于表4。将测定结果与理论值进行对比，计算得出本方法的回收率为95.4%～105.3%，说明本方法准确度较好。

2.3方法学比较用本方法分别与放射免疫分析

表3精密度测定结果(pg/ml/h，n=10，%)

Tab.3Precision measurement results (pg/ml/h，n=10，%)

SampleIntra-assayvariationxSDCVInter-assayvariationxSDCV1573.3532.115.6570.8759.3710.421767.26106.046.01719.45116.926.833851.68335.108.73776.92351.259.3

表4回收率测定

Tab.4Recovery test

Additionamount(pg/ml/h)PRAmeasuredvalue(pg/ml/h)PRAtheoreticalvalue(pg/ml/h)Recoveryrate%01125.32100645.13612.66105.3625890.55875.66101.739002397.082512.6695.4

图2　稀释实验Fig.2　Dilution test

方法同时测量63份血浆样品，并对计算得出的PRA值进行比较，其相关性结果见图3。可知本方法与放射免疫分析方法的相关性方程为y=0.95x+235.70，相关系数r=0.973。说明本方法与放射免疫分析方法具有良好的相关性。

2.4稳定性

2.4.1抗荧光素抗体包被板的稳定性将抗荧光素抗体包被板分别置于37℃ 1、3、5、7 d，然后进行化学发光免疫分析考查其稳定性。实验结果如图4所示。可知抗荧光素抗体包被板在37℃存放一周能保持良好的稳定性。

2.4.2生物素标记AngⅠ抗原的稳定性将生物素标记AngⅠ抗原工作液分别置于37℃ 1、3、5、7 d，然后进行化发光免疫分析考查其稳定性。实验结果如图5所示。可知生物素标记AngⅠ抗原在37℃存放一周稳定性良好。

2.4.3荧光素标记AngⅠ抗体的稳定性将荧光素标记抗体工作液置于37 ℃ 1、3、5、7 d，经免疫分析考查其随时间的变化情况。结果见图6 。可知荧光素标记抗体37℃存放一周稳定性良好。

图3　本方法与放射免疫分析方法的相关性Fig.3　Correlation between this method and radioimmunoassay

图5　生物素标记AngⅠ抗原的稳定性Fig.5　Stability of biotin labeled Ang Ⅰ antigen

图6　荧光素标记AngⅠ抗体的稳定性Fig.6　Stability of fluorescein labeled Ang Ⅰ antibody

3讨论

肾素是一种水解蛋白酶，由肾脏入球小动脉的近球细胞合成，贮存并释放到血液中，它直接作用于肝脏所分泌的血管紧张素原，使血管紧张素原转变成血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转移酶催化作用下转变成血管紧张素Ⅱ，并可引起醛固酮分泌，以此发挥对机体血压的调节作用[12]。

目前测定肾素活性在临床上应用较为广泛，临床检测值降低见于原发性高血压低肾素型、原发性醛固酮增多症、假性醛固酮增多症、糖皮质素抑制性醛固酮增多症等；升高见于原发性高血压高肾素型、巴特综合征、血管性高血压、肝硬化、肾上腺功能减退、心力衰竭等。肾素活性的测定对于临床评估高血压病人的身体状况是非常有意义的，尤其可用于诊断肾性高血压、原发性醛固酮增多症，并且可以帮助治疗和管理其他类型的高血压患者。

本工作建立了血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法，经方法学鉴定符合免疫分析的基本要求。此外本方法还具有良好的灵敏度、重复性和稳定性。用本方法与放射免疫分析方法对样品的测量值具有良好的线性相关。目前临床高血压等疾病诊断多采用国外进口试剂，其中测定肾素活性试剂有德国DRG和德国IBL公司的ELISA试剂盒，标准曲线范围都为0.2～60 ng/ml，相对较窄，而且价格较贵。本工作建立的血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法的标准曲线范围为100～7 800 pg/ml，而且方法建立中使用的抗血管紧张素Ⅰ抗体为本公司自制产品，可以节约成本，同时也为其诊断试剂盒的国产化奠定了基础。

参考文献：

[1]Giles TD,Bakris G,Oparil S,etal.Correlations of plasma renin activity and aldosterone concentration with ambulatory blood pressure responses to nebivolol and valsartan,alone and in combination,in hypertension[J].J Am Soc Hypertens,2015,9(11):845-854.

[2]刘洋，姜曼，陈丽震，等.血管紧张素Ⅱ1型受体基因rs3772622位点多态性与非酒精性脂肪性肝病发病风险的相关性分析[J].临床肝胆病杂志，2015,31(7)：1082-1087.

[3]姜娟,孙宁玲,王鸿懿,等.原发性高血压患者血浆肾素活性水平与血压和尿钠的关系[J].中华老年心脑血管病杂志,2012,14(8):810-813.

[4]郭媛博,闫朝丽.血醛固酮与肾素活性比值筛查原发性醛固酮增多症的流程及意义[J].广东医学,2013,34(8):1290-1292.

[5]Fischer E,Reuschl S,Quinkler M,etal.Assay characteristics influence the aldosterone to renin ratio as a screening tool for primary aldosteronism: results of the German Conn's registry[J].Horm Metab Res,2013,45(7):526-531.

[6]王爱红,郭琳琳.老年慢性心力衰竭患者血浆脑利钠肽、肾素活性及其血钠水平的相关性探讨[J].山东医药,2009 ,49(43):92-93.

[7] UC Brewster,MA Perazella.The renin-angiotensin-aldosterone system and the kidney: effects on kidney disease[J].Am J Med,2004,116(4):263-272.

[8] 霍颖,朱亚林,刘云.PRA、AT-Ⅱ和Ald在病毒性肝炎、肝硬化患者中的表达[J].放射免疫学杂志,2008,21(6): 537-538.

[9]Roda A,Pasini P,Mirasoli M，etal.Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence[J].Trends Biotechnol,2004,22(6):295-303.

[10]Bratthauer GL.The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods[J].Methods Mol Biol,2010,588(1):257-270.

[11]Kelly KA,Reynolds F,Weissleder R，etal.Fluorescein isothiocyanate-hapten immunoassay for determination of peptide-cell interactions[J].Anal Biochem,2004,330(2):181-185.

[12]符春晖,严华,陆永光,等.肾素-血管紧张素-醛固酮系统与原发性高血压病的关系[J].现代生物医学进展,2012,12(5):948-950.

[收稿2015-10-30修回2015-12-02]

(编辑倪鹏)

Establishment of chemiluminescence immunoassay for AngiotensinⅠ

YANG Chao-Yi,FENG Ting-Ting,ZHANG Xue-Feng,LU Jin-Hui,WANG Bin.

Atomic High Technology Limited Liability Company,Beijing 102413,China

[Abstract]Objective:The chemiluminescence immunoassay for AngiotensinⅠ (AngⅠ ) was developed by the competition method.The renin activity was calculated by the determination of Ang Ⅰ. Methods: AngⅠ antigen was labeled with biotin and fluorescein labeled AngⅠ antibody,and anti fluorescein antibody was used to coated with the microporous plate .Results: The standard range of the method was 100-7 800 pg/ml.The assay sensitivity was 24.3 pg/ml.The intra- and inter-assay coefficients of variance were 5.6%-8.7% and 6.8%-10.4% respectively.Analytical recovery was 95.4%-105.3%.The correlation coefficients between measured and expected values were 0.999 after serial diluted.Compared with radioimmunoassay kit,the correlative equation was y=0.95x+235.70,correlation coefficient was 0.973.Coated microporous plate and biotin labeled Ang Ⅰ antigen,and fluorescein labeled Ang Ⅰantibody at 37℃ for a week with good stability. Conclusion: The results of the method were in accord with the basic requirements of immunoassay.

[Key words]AngiotensinⅠ;Biotin;Fluorescein;Streptavidin-enzyme;Chemiluminescence immunoassay

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.015

作者简介：杨超一(1982年-)，女，硕士，助理研究员，主要从事免疫分析诊断试剂开发工作，同时就职于中国原子能科学研究院，E-mail:chaoyi_2008@163.com。

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0838-04