突变KRAS的互作化学分子研究

＊徐耀瑜 丁嘉颖 张雅慧 赵启程 张成杰 司伟杰

（安阳师范学院 化学与化工学院 河南 455000）

引言

癌症发生的主要原因是原癌基因的激活和抑癌基因的失活[1]。至今已观察到许多突变基因，例如RAS原癌基因家族成员——HRAS、KRAS、NRAS。其中KRAS在所有癌症中高频突变，特别是胰腺癌（98%）和结直肠腺癌（45%）[2-3]。KRAS基因编码GTPase（三磷酸鸟苷酶），结合GTP（三磷酸鸟苷），水解其为GDP（二磷酸鸟苷）。生长因子与细胞表面生长因子受体结合后，激活信号诱导GTP与KRAS结合，KRAS成为活化状态，作为分子开关来传递细胞内信号的传递[4]。

结直肠癌中KRAS突变主要为第12（G12D）或13（G13D）位氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代。该突变位于磷酸结合的效应结合环内，导致了GTP水解速率降低，GTPase交替开关的活性降低，导致KRAS诱导的信号通路改变，促进肿瘤细胞的增殖及转移[5]。KRAS发生G12D突变后，招募结合其他蛋白质因子，建立异常下游通路。通过AAVS1-CRIPR Cas9定点敲入BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS到SW48细胞，建立单基因研究系统。富集生物素化肽段，分析与野生型KRAS和突变型G12D结合的分子。

1.实验部分

(1)实验材料

人SW48细胞培养于RPMI 1640培养基，加入10%胎牛血清，2mM L型谷氨酰胺，100units/mL青霉素以及100μg/mL链霉素。通过AAVS1-CRISPR Cas9定点敲入融合基因BioIDWT-KRAS和BioID-G12D-KRAS的SW48细胞。上述细胞均置于37℃、5% CO2、湿度95%的细胞培养箱培养。

AAVS1-CRISPR Cas9系统包含AAVS1-CRISPR Cas9 clone（SH100），AAVS1 MCS donor cloning vector-Pure（SH200），5’鉴定PCR引物。Lipofectamine 3000（Thermo Fisher），生物素（Sigma），稳定同位素生物素（Iso-Sciences），G蛋白偶联琼脂糖珠（Millipore）。KRAS-4B抗体（3B10-2F2）(Sigma-Aldrich），生物素抗体（A150-109A）（BETHYL laboratories）。

(2)构建KRAS(WT/G12D)SW48细胞

将BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS基因片段分别插入AAVS1 MCS donor cloning vector-Pure（SH200）中。测序验证正确的质粒和AAVS1-CRISPR Cas9 clone（SH100）按1:1比例，使用Lipofectamine 3000转染SW48细胞，1μM puromycin筛选一周，挑选单克隆转至96孔板，继续培养2周。5'PCR扩增，及Western blotting检测BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS的目的条带及整体生物素标记效率，挑选正确插入基因，并且BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS表达水平相同的SW48细胞。

(3)稳定同位素生物素标记BioID-WT-KRAS和BioIDG12D-KRAS细胞

交替标记生物素：

组1，25μM正常生物素培养BioID-WT-KRAS细胞；

组2，25μM稳定同位素生物素培养BioID-G12D-KRAS细胞；

组3，25μM正常生物素培养BioID-G12D-KRAS细胞；

组4，25μM稳定同位素生物素培养BioID-WT-KRAS细胞。

每组培养4份15cm培养皿的细胞，Western blotting验证，取组1与组2的5mg细胞裂解液混合（A），取组3和组4的5mg细胞裂解液混合（B），A、B组均4个重复，胰酶消化，-80℃冻干。

(4)LC-MS/MS检测和分析生物素化肽段

富集A组和B组中的生物素化肽段。Orbitrap Fusion Lumos质谱仪上分析肽段样品，全扫描质谱从m/z350-1,550开始，分辨率为120,000，m/z为200，AGC最大值200,000个离子，占空比为3s，最大离子测试时间设定为60ms～100ms。数据库搜索以1%的错误发现率过滤PSM。统计分析BioID-G12D-KRAS组与BioID-WT-KRAS组，差异倍数2为界限，筛选显著差异。

2.实验结果

(1)BioID-G12D-KRAS与BioID-WT-KRAS肿瘤细胞的构建

将BioID-G12D-KRAS及BioID-WT-KRAS分别插入到SH200载体，转染SW48细胞，挑选单克隆继续培养，5'PCR方法验证，最终挑选出阳性BioID-G12D-KRAS和BioID-WTKRAS的SW48细胞各一株（图1.A）。扩大培养后，更换含50μM生物素的新鲜培养基，继续培养12h，收集细胞裂解液，Western blotting检测，鉴定出BioID-G12D-KRAS和BioID-WT-KRAS的表达水平相同（55kDa），内源性KRAS的表达水平也接近（图1.B）。两类细胞的生物素化蛋白表达水平一致（图1.C）。

图1 表达BioID-G12D-KRAS或BioID-WT-KRAS的SW48细胞

(2)质谱检测及基础数据分析

两种生物素交替标记野生KRAS和G12D突变KRAS的SW48细胞（图2）。Western blotting检测到每组样本中生物素标记情况相同，进行等比例混合样本，富集生物素化肽段（图3）。

图2 生物素标记方法

图3 两种生物素标记后不同SW48细胞的生物素修饰情况

富集的肽段经LC-MS/MS检测产生8个质谱文件，通过组合数据库搜索匹配，肽段定量分析，A组识别2,918个PSM和730个生物素化肽段，去除无法识别二级质谱的肽段，得到117个生物素化肽段（420个PSM）。B组得到716个生物素化肽段（2,632个PSM），去除无法识别到二级质谱的肽段，共识别107个生物素化肽段（353个PSM）。分析过程中，参考SW48细胞的16个天然生物素化蛋白质（PC，HLCS，CTTN，MCCC1，HIST1H2BD，CMA1，PTPRO，LRRCC1，TTC24，CA2，NUDT1，HIVEP1，MAP4，FBF1，ACTB，TXNDC12）。最终筛选出BioID-WT-KRAS细胞中88种生物素化蛋白质，BioID-G12DKRAS细胞中90种生物素化蛋白质。

(3)分析肿瘤结合分子

通过统计学分析，显著性差异的蛋白共13个，其中WTKRAS组中识别到8个生物素化蛋白质（AHNAK2，CYSRT1，ABI1，COL17A1，DSC2，SNAP29，PDLIM5，FAM126B），G12D-KRAS组中筛选出5个相互作用分子（SLC5A3，CBARP，BUB1B-PAK6，TC2N，SHB）（图4.A）。比对这部分数据，筛选出AHNAK2（AHNAK Nucleoprotein 2，AHNAK核蛋白2）仅在WT-KRAS组中被检测到（图4.B），SLC5A3仅在G12D-KRAS组中被生物素化（图4.C）[6]。

图4 WT-KRAS与G12D-KRAS的结合分子比较

WT-KRAS组识别到AHNAK2的同源蛋白AHNAK，是EGFR的已知相互作用蛋白。AHNAK为700 kDa蛋白质，在多种细胞中表达，在神经母细胞瘤中下调表达，AHNAK2功能未知[7]。WT-KRAS组AHNAK2的生物素化肽段丰度高于G12D-KRAS组，AHNAK2可能与WT-KRAS更稳定结合。SLC5A3（Solute Carrier Family 5 Member 3，溶质载体家族5A3），其家族有12个分子与KRAS存在蛋白相互作用[8]，主要功能防止高浓度肌醇在细胞内积聚造成高渗透压，导致细胞功能受损。该分子赖氨酸残基占全序列的4.3%，本次检测到2个生物素化标记位点，占全部32个赖氨酸残基的1/16。G12D组SLC5A3的K4位生物素修饰为WT-KRAS组2倍以上。

3.实验讨论

KRAS作为重要信号转导的高度调节性分子，自身结构改变，影响其与KRAS结合分子的相互作用，触发多样性的下游信号。发生突变的KRAS调控着大部分肿瘤的发生，其中第12氨基酸突变占所有KRAS突变的90%左右。本研究主要通过比较G12D突变与野生型KRAS于结合蛋白的差异，指出G12D突变后导致信号通路改变的关键分子，为潜在药物靶点研究提供线索。

我们利用特异识别生物素化位点[9]，依据生物素酶标记生物素于近距蛋白（小于10nm）赖氨酸残基的原理，针对G12D突变型和野生KRAS进行了肿瘤互作化学分子研究。

（1）首先构建了包含BioID的亲本和突变KRAS融合基因的SW48细胞，且表达融合蛋白水平一致。两组细胞背景一致时，二者不同的生物学特性，理论上由KRAS突变造成[10]。为简化分析，本部分采用两种生物素进行标记。考虑可能具体标记效率不一致，每种生物素分别标记两种细胞，最后综合定量分析出，BioID-WT-KRAS细胞中88种可能结合蛋白质，BioID-G12D-KRAS细胞中有90种潜在结合分子。

（2）又分析发现，G12D-KRAS有19种结合蛋白质（SLC 5A3，ACTN4，BUB1B-PAK6，CBARP，CXADR，EFNB1，FLNA，GNMT，LYN，MUC13，PFN1，PTTG1IP，RABL3，SHB，SPRED1，SPRED2，TC2N，TR53I11，TUBA1C），WTKRAS识别12种互作分子（AHNAK2，ABI1，AHNAK，COL17A1，CYSRT1，DSC2，FAM126B，PDLIM5，SLC19A1，SLC4A2，SNAP29，CDCA3）。生物素化AHNAK2只在WTKRAS细胞中被检测，生物素化SLC5A3仅在G12D-KRAS细胞内被识别。

AHNAK2和SLC5A3将作为潜在的肿瘤互作化学分子，在后续进行更多的研究，为我们深入认识KRAS，研制KRAS靶向药物提供前期工作基础。