波形蛋白的警报素功能鉴定①

陈　卓　夏　昶　余　兰　艾　思　方　成

(武汉轻工大学医学院移植免疫实验室，武汉430023)

波形蛋白的警报素功能鉴定①

陈卓夏昶余兰艾思方成

(武汉轻工大学医学院移植免疫实验室，武汉430023)

[摘要]目的：鉴定胞外可溶性波形蛋白(Vim)促进相关细胞增殖、活化、趋化的能力。方法：体外检测Vim刺激大鼠脾细胞的增殖情况。体内检测Vim免疫小鼠的外周血淋巴细胞数及Vim抗体水平。收集小鼠腹腔巨噬细胞与不同浓度Vim共培养，检测其对巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响。以Transwell小室法检测Vim对NIH3T3成纤维细胞的趋化作用。结果：体外实验Vim剂量依赖性地促进大鼠脾细胞增殖，16 μg/ml浓度的Vim刺激预致敏或未致敏脾细胞增殖率分别高达(196.0±9.7)%、(208.9±4.6)%，且该二者无显著性差异。体内实验单用Vim免疫小鼠的外周血淋巴细胞浓度(109 L-1)激增(5.74±0.51 vs.1.69±0.13)，同时激发了Vim特异性抗体水平(OD值2.31±0.06 vs.0.19±0.08)；且与Vim辅以佐剂免疫小鼠的相应指标均无显著性差异。体外实验Vim浓度依赖性地促进巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，并能够对NIH3T3成纤维细胞产生趋化作用。结论：胞外可溶性Vim非特异性促进炎症反应相关细胞增殖、活化、趋化，具有警报素功能。

[关键词]波形蛋白；增殖；活化；趋化；警报素

波形蛋白(Vimentin，Vim)为极度保守的真核细胞骨架Ⅲ型中间丝蛋白(IFs)，单体分子量约53 kD，常表达于中胚层起源的间充质细胞，多以多聚体纤维形态在胞内形成网状结构。胞内Vim参与细胞分化、迁移、介导感染和胞内免疫等功能，并随细胞凋亡而降解[1-5]。胞外Vim以胞膜外段、巨噬细胞分泌、细胞破裂后释放等形式存在。可溶性IFs约占总IFs的5%～10%，并与聚合态IFs在胞内保持动态平衡[6]。有研究显示Vim的Ⅱ号杆状结构域在胞膜表面具有识别N-乙酰葡糖胺的凝集素样活性基团[7]。活化的巨噬细胞能分泌Vim，TNF-α促进分泌，IL-10则反之[8]。因细胞坏死释放及巨噬细胞分泌的可溶性Vim，可与单核细胞非toll样模式识别受体Dectin-1结合，通过增强氧化应激反应参与动脉粥样硬化形成[9]。虽然Vim及其瓜氨酸修饰体的抗原性已普遍报道[10]，但胞外可溶性Vim的其他免疫功能尚有待揭示。本实验对Vim促进相关细胞增殖、活化、趋化的功能进行鉴定。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物及试剂Lewis大鼠(北京维通利华公司，雄性12～15周龄，许可证号SCXK京2006-2009)，BALB/c小鼠(湖北省实验动物中心，雌性6～8周龄，许可证号SCXK鄂2015-0018)，NIH3T3细胞(武汉大学细胞典藏中心)，Vim(Cytoskeleton公司)，Vim单抗(圣克鲁斯生物)，HRP标记羊抗鼠二抗(武汉博士德)，IL-8(Solarbio)，完全弗氏佐剂(CFA，Sigma)，RPMI 1640培养基(Sigma)，DMEM培养基(Solarbio)，胎牛血清(杭州四季青)，酶标板(Corning)，24/96孔板(Jet biofil)，Transwell小室(Corning)，CCK-8(碧云天生物)，瑞氏染液(Solarbio)。

1.1.2仪器设备CO2培养箱(Thermo)，全自动血细胞分析仪(Abbott公司)，高速冷冻离心机(日立GR21GⅢ)，酶标仪(Tecan sunrise)，正置/倒置显微镜(重庆明光)。

1.2主要方法

1.2.1体外脾细胞增殖实验近交系Lewis大鼠，体质量220～250 g。致敏组(n=3)皮下注射含25 μg Vim的PBS溶液100 μl，2周后加强1次；未致敏组(n=3)仅注射PBS。1周后无菌收获大鼠脾脏，将脾脏研磨通过200目不锈钢滤网。裂解红细胞后，有核细胞以PBS 清洗两次，台盼蓝拒染法计数，活细胞>95%。细胞重悬于10 %胎牛血清RPMI1640培养液。将含5×103个细胞的培养液50 μl/孔接种于96孔板，每孔另加入含Vim的血清RPMI 1640培养液50 μl，使Vim终浓度分别为2-2、2-1、20、21、22、23、24μg/ml。另设不含Vim的空白对照，及仅加有100 μl培养液的本底调零孔，均设3复孔。37℃、5% CO2条件下培养24 h后，每孔加10 μl CCK-8溶液继续培养4 h，即于酶标仪上测定450nm波长的吸光度。细胞增殖率=[(实验孔测定值-本底值)/(对照孔测定值-本底值)-1]×100%。

1.2.2外周血淋巴细胞增殖实验设3个实验组每组6只BALB/c小鼠。Vim免疫组皮下注射含200 μg Vim的PBS溶液100 μl；(Vim+CFA)免疫组皮下注射前述Vim溶液与等体积CFA的混合液；阴性对照组皮下注射100 μl PBS溶液；2周后剂量减半强化免疫1次。第3周眶静脉丛采血，肝素抗凝全血标本以全自动血细胞分析仪检测外周血淋巴细胞数量。

1.2.3外周血Vim抗体水平检测另取上述实验小鼠部分抗凝全血标本，离心取血浆，以ELISA(酶联免疫吸附试验)检测Vim特异性抗体水平。酶标板每孔加入100 μl Vim(5 μg/ml)PBS溶液包埋过夜，洗板并以1% BSA溶液150 μl封闭。洗板后加入各小鼠稀释血浆样本(1∶20)100 μl，另以加入100 μl PBS设为本底孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100 μl HRP标记羊抗鼠二抗(1∶4 000)，37℃孵育30 min后洗板；每孔加入100 μl TMB显色10 min后终止，于酶标仪上测定450nm波长的吸光度[11]。

1.2.4吞噬实验4只BALB/c小鼠每天1次连续3天腹腔注射6%淀粉肉汤1 ml，末次注射2 h后处死，以PBS液灌洗腹腔，合并灌洗液。1 500 r/min冷冻离心10 min，弃上清，用10%胎牛血清DMEM培养基重悬至细胞数为2×106ml-1，每孔1 ml接种于24孔板。设4组Vim终浓度为10、20、40、80 μg/ml及空白组，每组3复孔。每孔加入1%鸡红细胞PBS液100 μl，混匀。5%CO2、37℃条件下培养45 min，每5 min震板一次。每孔取100 μl溶液做细胞涂片，瑞氏染色后显微镜下每细胞涂片随机观察200个巨噬细胞，计算吞噬率及吞噬指数。吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞总数×100%；吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/计数的巨噬细胞总数×100%。

1.2.5趋化实验Transwell小室置于24孔板中，在上室加入含NIH3T3细胞数为3×104的DMEM培养基200 μl。下室设阳性组和3个Vim浓度梯度组，即500 μl DMEM培养基含终浓度为100 ng/ml的IL-8或10、20、40 μg/ml的Vim，每组3复孔，同时设阴性对照组。5%CO2、37℃条件下培养24 h。吸去上室细胞悬液，无菌棉签拭去碳酸脂膜上室面细胞，下室面浸入4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色3 min，每个实验孔显微镜下(×200)随机选取5个视野计穿过膜入下室的细胞数，并计算趋化指数(Chemotactic index，CI)。CI=实验组下室细胞数/阴性对照组下室细胞数[12]。

2结果

2.1Vim对体外培养脾细胞的增殖作用(图1C为浓度)分析实验结果发现Vim剂量依赖性(P<0.001)地刺激脾淋巴细胞增殖。实验中Vim最高浓度16 μg/ml刺激预致敏或未致敏脾细胞24 h的增殖率分别高达(196.0±9.7)%、(208.9±4.6)%，增殖数量提升接近于2倍。但Vim刺激预致敏或未致敏脾细胞的增殖率并无显著性差异(P>0.05)。提示Vim具有非特异性强烈刺激脾细胞增殖的作用，胞外可溶性Vim具有固有免疫活化功能。

2.2Vim免疫小鼠的外周血淋巴细胞数阴性对照组、Vim免疫组、(Vim+CFA)免疫组的外周血淋巴细胞数依次为(1.69±0.13)×109L-1、(5.74±0.51)×109L-1、(6.52±0.33)×109L-1(图2)。对比阴性组与Vim免疫组、阴性组与(Vim+CFA)免疫组的外周血淋巴细胞数均具有极显著性差异(P<0.001)，而Vim免疫组与(Vim+CFA)免疫组(5.74±0.51 vs.6.52±0.33，P>0.05)无显著性差异。结果显示皮下注射Vim促进小鼠外周血淋巴细胞增殖，数量增加2倍以上。而单独使用Vim免疫与(Vim+CFA)联合免疫刺激外周血淋巴细胞增殖的效能无显著性差异，体内实验提示Vim本身即具有强烈的非特异性免疫增强作用。

图1　体外检测Vim刺激脾细胞增殖作用Fig.1　Proliferation of splenocytes stimulated with Vim in vitro

图2　免疫小鼠外周血淋巴细胞数Fig.2　Number of peripheral blood lymphocytes in immunized miceNote: *.P<0.001 compared with group PBS.

2.3Vim免疫小鼠的特异性抗体水平ELISA测定对照组、Vim免疫组、(Vim+CFA)免疫组抗体水平的OD值依次为0.19±0.08、2.31±0.06、2.82±0.03(图3)，阴性组与Vim免疫组、阴性组与(Vim+CFA)免疫组的Vim抗体水平具有极显著性差异(P<0.001)，而Vim免疫组与(Vim+CFA)免疫组(2.31±0.06 vs.2.82±0.03，P>0.05)无显著性差异。提示单纯Vim免疫即能够产生高强度的免疫激活作用，CFA对Vim刺激并无显著的非特异性免疫强化辅佐作用。

2.4吞噬实验镜下依次观察空白组和Vim浓度梯度组，随着Vim浓度的增加巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力逐渐增强(图4)。计算吞噬率和吞噬指数(图5)，10 μg/ml Vim组与空白组存在非常显著差异(48.58±4.17 vs.26.65±4.35，P<0.01)，其余3组与空白组有极显著差异(P<0.001)。提示Vim能够促进巨噬细胞的吞噬功能，其活化巨噬细胞的能力呈现出一定的浓度依赖性。

图3　免疫小鼠血浆Vim特异性抗体水平Fig.3　Vim-specific antibody levels in plasmas of immunized miceNote: *.P<0.001 compared with group PBS.

图4　巨噬细胞吞噬鸡红细胞形态(×200)Fig.4　Macrophage morphology of phagocytosing chicken erythrocytes(×200)

图5　Vim对巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响Fig.5　Phagocytic rates and indexs of macrophages stimulated with VimNote: *.P<0.01 and **.P<0.001 compared with blank control group.

图6　Vim对3T3细胞的趋化作用Fig.6　Chemotaxis of Vim effecting on 3T3 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01 and ***.P<0.001 compared with negative group.

2.5趋化实验检测从Transwell上室通过碳酸脂膜微孔趋化到含Vim溶液下室的细胞数量，并计算趋化指数(图6)。可以发现与趋化因子IL-8作用相似，Vim 10 μg/ml组与阴性组的趋化指数(CI)有显著性差异(3.62±0.51 vs.1.00±0.34，P<0.05)，Vim 20 μg/ml、40 μg/ml组与阴性组的CI有非常显著差异(P<0.01)。显示Vim能够对NIH3T3成纤维细胞产生趋化作用，并呈现出浓度依赖性。

3讨论

自己成分的损伤相关分子模式(DAMPs)通过天然免疫细胞的模式识别受体(PRRs)诱导炎症反应[13]。在某些细胞内正常存在，当细胞受损或非程序性死亡时大量释放的DAMPs称为警报素(Alarmins)[14]。警报素在细胞内外行使不同的功能，在细胞外通过与相应PRRs结合发挥促进炎症的作用。具有促淋巴细胞活化与增殖的能力，并具有募集趋化能力，可行使增强机体免疫水平的类似佐剂的功能。较受关注的警报素有高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和IL-33[15,16]，另外还包括α-防御素(HNP1-4和HD5-6)和β-防御素(HBD1-4)、抗菌肽(CAP18)、嗜酸粒细胞衍生神经毒素(EDN)[17]。HMGB1在胞核普遍存在，可与Toll样受体TLR2/4/9及糖基化终产物受体(RAGE)结合[18]。IL-33主要表达于平滑肌细胞及气管上皮细胞，可与异源二聚受体ST2L/IL-1RAcP 结合，受体胞质区的Toll-IL-1受体(TIR)结构域募集MyD88、IRAK1和IRAK4，启动TRAF6依赖的MAPK通路增强促炎因子的表达[19]。α-防御素储存于中性粒细胞和小肠潘氏细胞的颗粒，β-防御素在角质细胞和上皮细胞表达，其中HBD2通过TLR4激活DC细胞。CAP18在中性粒细胞和肥大细胞的颗粒及上皮细胞中都有表达，其酶解片段LL-37通过受体FPRLl发挥募集单核细胞的作用，并经MAPK信号通路活化巨噬细胞。EDN储存在嗜酸性粒细胞的颗粒中，通过TLR2来激活DC细胞。警报素作为与固有免疫关系密切的因素，可激发和促进适应性免疫应答，是生物治疗的新兴靶点。

Vim作为保守的Ⅲ型中间丝蛋白，常存在于成纤维细胞、血管内皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞内，在肾小球、肾小管及肾间质细胞内也有丰富表达[20]。当出现感染或损伤等因素时，Vim会随着细胞的破损而暴露或释放于胞外，参与固有免疫调节。有研究发现Vim基因敲除小鼠的巨噬细胞产生更多的活性氧代谢物(ROS)增强杀菌能力；Vim通过与NADPH氧化酶的p47phox亚单位相互作用可抑制ROS的产生[4]。另一研究发现Vim是模式识别受体NOD2的协同蛋白，胞内Vim具有协助NOD2介导的NF-κB通路活化的功能；病理状态下，NOD2不能与Vim结合，导致NOD2介导的易感菌防御能力降低，促进炎症性肠病(CD)的发展[21]。最近有报道指出胞外Vim可与C型凝集素受体Dectin-1结合，可能通过活化巨噬细胞的氧化应激反应，促进动脉粥样硬化的形成[9]。

本研究通过体外和体内实验发现，胞外可溶性Vim均能够非特异性强烈刺激淋巴细胞增殖，提升效率高达2倍，并能激发强烈的体液免疫应答。单纯Vim免疫即能够产生高强度的免疫激活作用，而CFA的非特异性免疫增强作用对Vim刺激的辅佐作用有限。吞噬实验结果显示Vim能够活化巨噬细胞的吞噬能力，趋化实验结果显示Vim具有诱导成纤维细胞趋化的功能，且均呈现浓度依赖性。综上证实Vim具有警报素的功能特性，为深入探究Vim在免疫反应、炎症及慢性纤维化的交互过程中发挥的功能作用奠定了基础。

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[收稿2016-03-08]

(编辑张晓舟)

Functional verification of vimentin as an alarmin

CHEN Zhuo,XIA Chang,YU Lan,AI Si,FANG Cheng.

Laboratory of Transplant Immunology,Wuhan Polytechnical University,Wuhan 430023,China

[Abstract]Objective:To identify the function of extracellular soluble vimentin that promotes proliferation,activation and chemotaxis of inflammatory cells.Methods: The proliferation of rat splenocytes stimulated with vimentin was evaluated in vitro.The lymphocyte counts and vimentin-antibody levels of peripheral blood in mice immunized with vimentin were detected in vivo.Peritoneal macrophages were collected and cultured with different concentrations of vimentin to detect the effect on phagocytosing chicken red blood cells.The chemotaxis of NIH3T3 fibroblast towards vimentin was observed in transwell chamber.Results: In vitro vimentin dose dependently promoted the proliferation of splenocytes.The proliferation indexes of primed and naive splenocytes cultured with 16 μg/ml vimentin were reached up to(196.0±9.7)% and(208.9±4.6)% respectively without significant difference.In vivo vimentin significantly enhanced the lymphocytes number(109 L-1)of peripheral blood(5.74±0.51 vs.1.69±0.13)and the levels of vimentin specific antibody(OD value 2.31±0.06 vs.0.19±0.08)that shown no significant difference from immunization with vimentin plus CFA.In vitro vimentin dose dependently stimulated phagocytic ability of macrophages and performed the chemotactic effects on NIH3T3 fibroblasts.Conclusion: Extracellular soluble vimentin promotes the proliferation,activation and chemotaxis of concerned inflammatory cells and possesses the functions as an alarmin.

[Key words]Vimentin;Proliferation;Activation;Chemotaxis;Alarmin

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.006

作者简介：陈卓(1990年-)，女，在读硕士，主要从事免疫药理学研究，E-mail:chenzhuoc@sina.com。 通讯作者及指导教师：方成(1972年-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事免疫生物学和免疫药理学研究，E-mail:fang_cheng@foxmail.com。

中图分类号R392.12

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0798-05

①本文受湖北省自然科学基金项目(2015CFC845)、国家自然科学基金项目(31370867)和武汉轻工大学研究生创新基金项目(2013CX021)资助。