四君子汤含药脑脊液对溃疡性结肠炎肠黏膜淋巴细胞功能的影响①

李进安　王永多　王　奎　贾道勇

(重庆三峡中心医院肛肠科，重庆404000)

四君子汤含药脑脊液对溃疡性结肠炎肠黏膜淋巴细胞功能的影响①

李进安王永多王奎贾道勇

(重庆三峡中心医院肛肠科，重庆404000)

[摘要]目的：探讨四君子汤含药脑脊液对体外培养的溃疡性结肠炎肠黏膜淋巴细胞功能的影响。方法：制备大鼠四君子汤和美沙拉嗪含药脑脊液，收集并分离12例健康体检者(作为正常对照组)和18例溃疡性结肠炎肠黏膜固有层淋巴细胞，分为5组：病理组、IL-12诱导组、空白脑脊液组、含药脑脊液组、美沙拉嗪脑脊液组；通过不同处理方式体外作用细胞后，采用CCK-8检测各组细胞增殖能力；流式细胞术检测其周期分布及CD4+T细胞比例；ELISA检测细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-ɑ细胞因子的能力；Western blot检测细胞内IL-2蛋白的表达。结果：与IL-12诱导组和空白脑脊液组比较，含药脑脊液组细胞增殖能力下降，细胞周期阻滞在G0/G1期，CD4+T细胞比例明显减少，IL-1、IL-6、TNF-ɑ细胞因子分泌能力明显下降，IL-2蛋白表达水平显著下调。结论：四君子汤含药脑脊液在体外能降低溃疡性结肠炎肠黏膜淋巴细胞的功能，其机制可能与四君子汤调控其分泌IL-1、IL-6、TNF-ɑ等细胞因子相关。

[关键词]四君子汤；含药脑脊液；溃疡性结肠炎；机制

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种病因尚不十分清楚的直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病。目前研究认为溃疡性结肠炎并非单一因素所致，而是由遗传、环境、微生物及肠道共生菌和黏膜免疫/炎症系统等因素共同作用,最终使肠道黏膜组织免疫平衡被打破，肠道免疫反应亢进引起黏膜损伤[1]。现代医学研究证明许多传统中医方剂具有免疫调节作用，其中四君子汤就是通过该机制发挥药效作用的方剂之一，且研究证实其对多种自身免疫性疾病表现较好的功效[2-7]，然而四君子汤对UC免疫调节作用及其机制的研究,目前尚未见报道。本研究通过制备四君子汤含药脑脊液,进一步探讨其对UC黏膜内免疫细胞功能的作用及其机制，为针对调节UC免疫功能，且低毒高效的天然药物的开发提供理论和实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物人参(批号130801，吉林)，白术(批号131001，四川)，茯苓(批号130601，云南),甘草(批号130901，内蒙古)，由我院钟良才副主任药师鉴定。准确称量各药物：人参10 g，白术10 g，茯苓10 g,甘草5 g,按照药典的方法浓缩成相当于生药的0.4 g/ml。美沙拉嗪肠溶片购置于葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，研碎后溶于生理盐水。

1.1.2动物雌性SD大鼠30只，体重180～200 g，重庆医科大学实验动物中心提供[合格证号SCXK(渝2007-0001)]。

1.1.3试剂RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(碧云天公司)；FITC标记的Anti-CD4(美国eBioscience公司)；ELISA试剂盒(武汉博士德公司)；Anti-IL-2一抗，羊抗兔二抗(Bioss公司)。

1.2方法

1.2.1 四君子汤及美沙拉嗪含药脑脊液的制备将大鼠随机分为3组，每组10只。四君子汤含药脑脊液组大鼠每日给予相当于生药量4 mg/(kg·d)灌胃，美沙拉嗪150 mg/(kg·d)给予灌胃，空白组给予生理盐水灌胃，三组给药体积相同，共2周。后参照文献[8]提取各组大鼠脑脊液。

1.2.2样本收集及肠黏膜淋巴细胞的分离及分组本科2012年1月～2013年6月经肠镜及病理诊断的溃疡性结肠炎患者18例,均符合诊断标准[9]，且均为初诊病人，未经任何相关治疗，男女各半，年龄28～45岁，平均(35.5±6.4)岁。健康体检者12例，男女各半，年龄30～41岁，平均(34.8±5.2)岁。两组人群年龄无统计学差异(P>0.05)。

参照文献[10]收集并分离肠黏膜淋巴细胞。将分离收集的细胞分为8组；正常对照组(C)：获取的健康体检者肠黏膜淋巴细胞；病理组(P)：获取的UC患者肠黏膜淋巴细胞；IL-12诱导组(S )：在P组基础上加入终浓度为1 mg/L IL-12；含药脑脊液组(低，L)：在S组基础上加入5%(体积，余下同)的四君子汤含药脑脊液；含药脑脊液组(中，M)：与10%的四君子汤含药脑脊液共培养(余同L组)；含药脑脊液组(高，H)：在S组基础上加入15%的四君子汤含药脑脊液；美沙拉嗪脑脊液组(ME)：在S组基础上加入10%的美沙拉嗪含药脑脊液；空白脑脊液组(CSF)：与10%的正常大鼠脑脊液共培养(余同L组),各组用培养基补至等量培养体系[11]。

1.2.3CCK-8实验检测淋巴细胞增殖能力收集分选的淋巴细胞，按5×103细胞 /100 μl /孔接种于96孔板中，常规培养1 h。按照分组方案，各组加入不同的药物处理,用培养基补至200 μl总体系。每组设置5个复孔，分别培养24、48、72 h后各孔加入10 μl CCK-8培养4 h，酶标仪检测OD450 的吸光度值，评价细胞增殖能力。

1.2.4流式细胞术检测淋巴细胞周期分布及CD4+T细胞比例收集分离的淋巴细胞，并调整细胞数为1×107ml-1，按1×106细胞/2 ml/孔接种于12孔板中，每组均设置3个复孔，在37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h，按照分组方案，各组加入不同的药物处理48 h后2 000 r/min×5 min离心，获取细胞。收集培养上清液于EP管中，用于以下细胞因子浓度的检测。将经上述方法获取的各组淋巴细胞用PBS洗涤2次。一部分用-20 ℃的70%乙醇4℃固定过夜，与RNase A在37℃下共培养30 min后用PI染色30 min，流式细胞仪检测分析细胞周期。另一部分细胞用FITC标记的小鼠抗人CD4抗体(1∶100)于4℃孵育30 min后经流式细胞仪检测CD4+T细胞比例。

1.2.5ELISA检测淋巴细胞分泌细胞因子能力按试剂盒说明书检测，设置酶标仪吸光度为450 nm，测定其OD值，使用Curve Exert 1.3软件计算各组淋巴细胞分泌的因子值。

1.2.6Western blot检测淋巴细胞IL-2的表达提取各组淋巴细胞总蛋白，调整蛋白浓度40 μg/泳道，SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗IL-2(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶3 000) 4℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，洗膜，ECL发光系统显色。用FluorSTMMultimager 图像分析仪，Quality-One4.11软件进行图像灰度扫描处理。

2结果

2.1四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞增殖的影响如图1所示结果表明，细胞培养48 h后，与IL-12诱导组和空白脑脊液组比较，含药脑脊液组(低，高)淋巴细胞无明显的增殖抑制作用，含药脑脊液组(中)淋巴细胞呈现明显的增殖抑制，与美沙拉嗪脑脊液组比较，其增殖抑制无统计学意义，表明该浓度含药脑脊液对淋巴细胞的抑制作用接近美沙拉嗪。因此，以下试验均选取此浓度(10%体系的含药脑脊液)作为药物实验的标准。

2.2四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞周期分布的影响正常对照组和病理组多数细胞处于G0/G1期，这符合淋巴细胞处于终末分化细胞的特性，空白脑脊液组和IL-12诱导组多数细胞处于S期，说明IL-12可以激活炎性细胞并促进其增殖的功能。与空白脑脊液组和IL-12诱导组相比，含药脑脊液组细胞G0/G1期细胞分布比例明显增加，与美沙拉嗪脑脊液组比较降低不明显(图2)。

图1　四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞增殖的影响%，n=5)Fig.1　Effects of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on proliferation of lymphocytes in %，n=5)Note: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

图2　四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞周期分布的影响%，n=5)Fig.2　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on cell cycle of ±s，%，n=5)Note: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

2.3四君子汤含药脑脊液对CD4+T细胞比例的影响如图3所示结果表明，与正常对照组比较，病理组、IL-12诱导组及空白脑脊液组CD4+T比例显著增高。含药脑脊液作用48 h后其比例明显降低，与美沙拉嗪脑脊液组比较两者无统计学意义。

2.4四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞分泌致炎因子能力的影响与正常对照组、病理组比较，IL-12诱导组及空白脑脊液组分泌IL-1、IL-6、TNF-ɑ水平明显增高。含药脑脊液作用48 h后其比例明显降低，与美沙拉嗪脑脊液组比较两者无统计学差异(图4)。

2.5四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞IL-2表达的影响与IL-12诱导组及空白脑脊液组比较，含药脑脊液组淋巴细胞IL-2表达水平降低，将蛋白与对应的内参灰度的比值进行分析，差异具有统计学意义(P<0.05，图5)。

图3　四君子汤含药脑脊液对CD4+T细胞比例的影响±s，%，n=5)Fig.3　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on ratio of ±s，%，n=5)Note: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

图4　四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞分泌细胞因子能力的影响Fig.4　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on cytokine-producing of lymphocytesNote: vs C and P，*.P<0.05；vs S and CSF，#.P<0.05.

图5　四君子汤含药脑脊液对淋巴细胞IL-2表达影响%，n=5)Fig.5　Effect of rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi decotion on expression of IL-2 of %，n=5)

3讨论

溃疡性结肠炎(UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种迄今病因不明但与自身免疫相关的炎症性肠病，有慢性反复发作等特点，被WHO列为难治病之一[12]。目前治疗该疾病主要是5-氨基水杨酸类药物等，但这类药物都存在不同的毒副作用，如胃痛、头痛、关节痛等，甚至是白细胞减少及粒细胞缺乏等较严重的不良反应，发生率较高约为15%～20%，因此其临床应用受限制[13]。中医药学是中华民族几千年来防病治病经验的结晶，是具有中国特色的生命科学，现代医学研究证明许多中医方剂具有免疫调节作用。因此祖国传统医学为寻找既能调节UC免疫功能，又低毒高效的天然药物提供了可能。

传统医学中并没有与UC完全对应的病名，根据临床特征，类似于“痢疾”、“下痢”等疾病，且认为其发病机制为“脾气受损”，而四君子汤是“益气健脾”的经典方剂。初步研究证实此方治疗IBD总有效率达80%以上。

IL-12在炎症性肠病的发病中起重要作用，可以激活患者肠黏膜固有层淋巴细胞,并产生大量促炎症介质[14]。 本研究在成功分离人肠黏膜组织内淋巴细胞的基础上，使用IL-12激活淋巴细胞后用不同的处理方式体外作用细胞。结果证明，四君子汤含药脑脊液对IL-12刺激的UC患者肠淋巴细胞的增殖有显著的抑制作用，并且其作用后使细胞阻滞于G0/G1期。CD4+T细胞在机体免疫调节中发挥着非常关键的作用，IL-12可以激活肠道内的CD4+T，导致Th1样的慢性结肠炎[15]，本研究发现IL-12刺激的UC患者肠淋巴细胞经四君子汤含药脑脊液作用48 h后，其CD4+T细胞比例明显降低。研究证实，四君子汤含药脑脊液不仅可抑制UC患者肠淋巴细胞的增殖，还能降低CD4+T细胞比例。

IL-1和TNF-α是IBD发病中重要的细胞因子，IL-1和TNF-α通过上调血管内皮细胞和白细胞黏附分子的表达，促进炎症细胞与血管内皮细胞的黏附作用，有助于白细胞的炎性渗出。IL-1和TNF-α等可增强单核-吞噬细胞、中性粒细胞的吞噬杀伤功能，促进其分泌炎症介质。IL-1和TNF-α还可刺激血管内皮细胞释放一系列炎性介质。IL-1与其受体结合后，通过核转录因子-κB(NF-κB)启动包括IL-6、TNF-ɑ等在内的多种因子的表达、释放。研究报道UC患者肠黏膜固有层单个核细胞表达IL-1、IL-6、TNF-ɑ水平明显升高，且升高程度与疾病严重程度、累及范围以及复发密切相关[16]；其分泌的TNF-α可进一步损伤结肠组织，使肠道炎症反应放大，引起瀑布式反应，而抑制TNF-α的合成、分泌可以有效地减轻肠道炎症。TNF-α被认为是UC炎症的关键分子[17]。IL-2通过促进NK细胞和T细胞的增殖，诱导NK等其他淋巴细胞产生TNF-α等细胞因子，促进B淋巴细胞的增殖分化。本研究发现，四君子汤含药脑脊液作用于UC患者肠黏膜淋巴细胞后，使IL-1、IL-6、TNF-ɑ、IL-2等表达水平降低，这提示四君子汤含药脑脊液对UC患者肠黏膜淋巴细胞的增殖抑制作用是通过抑制其分泌细胞因子实现的。

综上所述，四君子汤含药脑脊液能有效抑制UC患者肠黏膜淋巴细胞的功能，其机制可能与其能降低淋巴细胞分泌的细胞因子相关。我们的研究结果为溃疡性结肠炎的治疗提出了新的策略和途径。

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[收稿2016-01-06修回2016-04-16]

(编辑倪鹏)

Effect of cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction on function of colon mucosa lymphocytes of ulcerative colitis in vitro

LI Jin-An,WANG Yong-Duo,WANG Kui,JIA Dao-Yong.

Chongqing Three Gorges Center Hospital，Section Anorectal,Chongqing 404000，China

[Abstract]Objective:To explore the effects of cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction on function of colon mucosa lymphocytes of ulcerative colitis in vitro.Methods: Prepared the rat cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction or Mesalamine.Collected colon mucosa of the 12 healthy (as normal group) and 18 ulcerative colitis,then isolated and obtained lymphocytes from these samples.The lymphocytes were divided into pathological group，IL-12 group，cerebrospinal fluid group cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction group，cerebrospinal fluid contained Mesalamine group.After exposing to various treatment,the proliferative capacity was measured by CCK-8,the cell cycle and the ratio of CD4+T was analyzed by flow cytometry(FCM),the content of IL-1，IL-6，TNF-α was detected by ELISA.The expression of IL-2 were detected by Western blot analysis.Results: Compared the cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction group with the IL-12 group or cerebrospinal fluid group,the proliferative capacity and the percentage of CD4+T was decreased,the cells significantly arrested at G0/G1 phase,the secretory capability of IL-1，IL-6，TNF-α were obviously reduced;the expression of IL-2 was also significantly down-regulated.Conclusion: The cerebrospinal fluid contained Sijunzi Decoction could decrease the function of colon mucosa lymphocytes of ulcerative colitis,the mechanism involved in may be Sijunzi Decoction regulating the secretory capability of IL-1，IL-6 and TNF-α.

[Key words]Sijunzi Decoction;Cerebrospinal fluid contained drug;Ulcerative colitis;Mechanism

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.010

作者简介：李进安(1978年-)，男，硕士，主治医生，主要从事炎症性肠病的基础与临床研究，E-mail:lijinan@126.com。

中图分类号R329.2R733.7

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0815-05

·中医中药与免疫·

①本文为重庆市卫生与计划生育委员会中医药科技项目。