乏氧激活人口腔鳞癌细胞DKKL1的表达

王建秋　范如意　谢其洋　闫风琴

(杭州师范大学医学院生物化学与分子生物学教研室，浙江　杭州　310036)

·基础研究·

乏氧激活人口腔鳞癌细胞DKKL1的表达

王建秋范如意谢其洋闫风琴1

(杭州师范大学医学院生物化学与分子生物学教研室，浙江杭州310036)

〔摘要〕目的探讨常氧和乏氧条件下人口腔鳞癌细胞Dickkopf样蛋白-1(DKKL1)的表达及可能的表观遗传学机制。方法取对数生长期人口腔鳞癌SAS细胞和OECM-1细胞，常氧或乏氧(1.0% O2)条件下培养18 h，采用实时荧光定量PCR方法检测DKKL1 mRNA水平的表达，采用Western印迹方法检测其蛋白水平的表达；进一步采用染色质免疫沉淀(ChIP)方法检测DKKL1基因启动子上H3K4乙酰化(H3K4ac)和二甲基化(H3K4me2)水平的变化。结果与常氧条件下相比，乏氧使DKKL1在SAS和OECM-1两种口腔鳞癌细胞中的表达均显著升高，其mRNA水平分别为常氧条件下的(4.0±0.4)倍(P<0.01)和(2.4±0.1)倍(P<0.01)；ChIP结果显示，乏氧增加了DKKL1基因启动子上H3K4ac水平，降低了H3K4me2水平。结论乏氧可激活口腔鳞癌细胞DKKL1的表达，该作用可能与乏氧调节DKKL1基因启动子上组蛋白H3K4的乙酰化和二甲基化修饰有关。

〔关键词〕口腔鳞癌；乏氧；Dickkopf样蛋白-1；组蛋白修饰

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是常见的上皮来源头颈部恶性肿瘤，目前，其发生和转移的分子机制尚不清楚。乏氧是肿瘤微环境的基本特征之一，通过激活缺氧诱导因子(HIF)-1α诱导的上皮细胞间质转化(EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程〔1，2〕。Dickkopf样蛋白-1(DKKL1)基因启动子上的组蛋白3(H3)化学修饰受到乏氧调节，由此推测，DKKL1的表达可能受到乏氧的调节作用，并可能在乏氧诱导肿瘤EMT过程中发挥作用。而关于DKKL1与肿瘤的相关性，目前鲜有报道。本研究拟检测DKKL1基因启动子上组蛋白标记H3K4乙酰化(H3K4ac)、H3K4二甲基化(H3K4me2)的化学修饰变化，初步探讨乏氧调节DKKL1表达可能的表观遗传学机制。

1材料与方法

1.1主要材料人口腔鳞癌细胞系SAS和OECM-1(台湾阳明大学生化暨分子生物研究所惠赠)；改良型RPMI-1640培养基(Thermo)；胎牛血清(Gibco)；总RNA提取试剂RNAiso Plus(TaKaRa)；反转录酶试剂盒(TaKaRa)；Real-time qPCR试剂盒UltraSYBRMixture(CWBIO)；DKKL1兔抗人多克隆抗体(Millipore)；Magna ChIPTM protein A+G magnetic beads(Millipore)；ChIPAb+ acetyl-histone H3(Lys4)set(Millipore，含兔抗人单克隆抗体、阴性对照IgG和GAPDH阳性对照引物)；ChIPAb+ dimethyl-histone H3(Lys4)set(Millipore，含鼠抗人特异性抗体、阴性对照IgG和GAPDH阳性对照引物)。

1.2主要仪器APM-30DR三气培养箱(ASTEC，日本)；7500型荧光定量PCR仪(ABI，美国)；Odyssey双色红外荧光扫描成像系统(LI-COR，美国)。

1.3方法

1.3.1细胞的常氧培养和乏氧处理取生长状态良好的SAS细胞和OECM-1细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5%CO2进行常规培养。乏氧处理：取常规培养的细胞，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基换液，置于三气培养箱中，将氧浓度调整为1%后继续培养18 h。

1.3.2实时荧光定量PCR检测mRNA水平用Trizol法提取各组细胞的总RNA，采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA。Real-time PCR 的引物合成在上海捷瑞生物工程有限公司完成，引物设计：DKKL1上游：5′-GGGATGGAGTTCTGTGTGGA-3′，下游：5′-AGCTTCGAGGGTGATTTGAA-3′，18S rRNA上游：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游：5′-CCATCCAATCGGTAG TAGCG-3′。采用SYBR-Green染料法进行定量PCR，循环条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃复性30 s，72℃延伸20 s，40个循环。根据熔解曲线评估引物特异性。以18S RNA为内参，采用2-△△CT法进行相对定量分析，每次试验设三复孔，行三次独立重复试验。

1.3.3Western印迹检测蛋白表达提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，取60 μg蛋白样品作十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶，10%分离胶)。将凝胶上的蛋白转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF 膜与DKKL1抗体(1∶1 000)在4℃摇床下孵育过夜后，再与结合有荧光染料的二抗孵育。应用Odyssey红外扫描系统对 PVDF 膜进行扫描成像。以β-actin(抗体稀释比例为1∶1 000)作为内参照。

1.3.4染色质免疫沉淀(ChIP)实验1%甲醛固定细胞10 min，依次裂解细胞膜和细胞核。超声破碎染色质DNA，使其片段长度分布在200～1 000 bp。以稀释缓冲液将染色质悬液稀释5倍，取2%作为对照，剩余部分五等分，分别加入抗H3K4ac、抗H3K4me2抗体和兔正常IgG、小鼠正常IgG，4℃摇床孵育过夜。应用磁性A/G琼脂糖株收集免疫沉淀复合物，充分洗涤后65℃水浴过夜。应用PCR产物提取试剂盒提取DNA，以此为模板，应用合成的DKKL1启动子特异性引物(上游5′-CCCCGTTCTCAGCTTGATGT-3′，下游5′-TTCTTCCCTGGTGTCCATGC-3′)，SYBR green染色法进行Real-time PCR扩增。

1.4统计学分析采用SPSS20.0软件行t检验。

2结果

2.1乏氧激活DKKL1在口腔鳞癌细胞中的表达实时荧光定量PCR结果显示，乏氧显著激活了两种口腔鳞癌细胞系中DKKL1的转录(SAS细胞，常氧条件DKKL1 mRNA 0.075±0.001，乏氧条件0.300±0.027；OECM-1细胞：常氧条件DKKL1 mRNA 0.355±0.027，乏氧条件0.853±0.040)。乏氧处理18 h后，DKKL1在SAS细胞中的mRNA相对表达量是常氧条件下的(4.0±0.4)倍，而在OECM-1细胞中则是常氧条件下的(2.4±0.1)倍。与常氧条件相比，乏氧处理后SAS和OECM-1细胞DKKL1的蛋白表达均显著增高。见图1。

图1　Western印迹检测SAS、OECM-1细胞中DKKL1蛋白的表达

2.2乏氧调节DKKL1启动子上的组蛋白修饰与常氧条件相比，乏氧处理可使OECM-1细胞DKKL1基因启动子上的H3K4乙酰化水平显著升高(H3K4ac抗体：常氧条件H3K4乙酰化水平0.237±0.024，乏氧条件1.156±0.079;兔正常IgG：常氧条件H3K4乙酰化水平0.039±0.004,乏氧条件0.038±0.004)，达常氧条件下的(4.9±0.3)倍；而其二甲基化水平则明显降低(H3K4 me2抗体：常氧条件下H3K4二甲基化水平4.042±0.399,乏氧条件0.383±0.039；小鼠正常IgG：常氧条件下H3K4二甲基化水平0.163±0.015,乏氧条件0.323±0.027)。

3讨论

DKKL1属于Dickkopf超家族成员，目前对其功能的认识相对较为局限，主要集中于其对精母细胞凋亡的调控作用〔3〕。不过最近有研究报道，DKKL1可能参与包括高级别胶质瘤在内的多种肿瘤的调控〔4〕，但具体机制不清。Dickkopf蛋白家族多个成员(如DKK1、DKK3)是Wnt/β-catenin信号通路的有效拮抗剂，同时又受Wnt/β-catenin的反馈调节〔5，6〕，预示着该家族蛋白功能的复杂性。如DKK1一方面被报道为肿瘤抑制因子，在结肠癌和黑色素瘤中表达下调〔7〕；另一方面又被报道在乳腺癌、肺癌和肝癌中表达明显增高，并促进了肝癌的侵袭和转移〔8〕。DKKL1是否也具有类似的肿瘤调节作用？本实验结果显示，在常氧条件下培养的口腔鳞癌细胞，无论是DKKL1的mRNA水平还是蛋白质表达水平，都是非常低的。而之前关于DKKL1在正常组织中表达的报道，也仅见表达于睾丸组织〔4〕。然而，在缺氧诱导口腔鳞癌EMT的表观遗传学机制研究中，从高通量测序数据中发现DKKL1基因启动子上的组蛋白修饰可能受到乏氧的显著调控。口腔鳞癌增长迅速，易造成局部乏氧微环境〔9〕，而乏氧是诱导肿瘤细胞EMT、促进肿瘤侵袭和转移的重要刺激因子。目前，尚未见乏氧影响肿瘤细胞DKKL1表达的相关报道。而本实验中，乏氧激活了DKKL1在口腔鳞癌细胞中的表达。

组蛋白修饰调节可改变染色质结构，影响转录因子与启动子或其他顺式作用元件的结合，调节基因表达〔10〕。组蛋白H3/H4的位点特异性乙酰化通常会引起基因转录激活，去乙酰化则导致转录抑制〔11〕。组蛋白的甲基化和去甲基化修饰对基因的转录调节各不相同〔12〕。本实验采用ChIP方法，发现与常氧条件相比，乏氧显著增加DKKL1启动子上H3K4乙酰化水平，而降低了其二甲基化水平。因此推测乏氧通过对基因启动子上的组蛋白H3K4位点特异性乙酰化和二甲基化的协调调节实现了对DKKL1的转录激活作用,符合染色质的“二价域”(bivalent domains)调节基因功能的理论〔13〕。

Wnt/β-catenin是EMT过程中重要的信号转导通路之一,DKKL1会否像DKK1或DKK3一样参与Wnt/β-catenin信号通路的调节，并通过该信号通路参与调节EMT，有待深入研究。

4参考文献

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2孙昊轩，冯红超，宋宇峰.Twist在口腔鳞状细胞癌中的表达及其与鳞状细胞癌上皮间质化的关系〔J〕.华西口腔医学杂志,2015;33(5):534-8.

3Shahbazian MD,Grunstein M.Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation〔J〕.Ann Rev Biochem 2007;76(1):75-100.

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7Kuphal S,Lodermeyer S,Bataille F,etal.Expression of Dickkopf genes is strongly reduced in malignant melanoma〔J〕.Oncogene,2006;25(36):5027-36.

8Gobel A,Browne AJ,Thiele S,etal.Potentiated suppression of Dickkopf-1 in breast cancer by combined administration of the mevalonate pathway inhibitors zoledronic acid and statins〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2015;154(3):623-31.

9江琳琳，韩伟，王志勇.低氧促进口腔鳞癌细胞TLR3及TLR4表达的相关研究〔J〕.口腔医学，2015;35(10):806-9.

10王维，孟智启，石放雄.组蛋白修饰及其生物学效应〔J〕.遗传，2012;34(7)：810-8.

11Wang JQ,Wu KJ.Epigenetic regulation of epithelial-mesenchymal transition by hypoxia in cancer:targets and therapy〔J〕.Curr Pharm Des,2015;21(10):1272-8.

12Sarris M,Nikolaou K,Talianidis I.Context-specific regulation of cancer epigenomes by histone and transcription factor methylation〔J〕.Oncogene,2014;33(10):1207-17.

13Jiang H,Shukla A,Wang X,etal.Role for Dpy-30 in ES cell-fate specification by regulation of H3K4 methylation within bivalent domains〔J〕.Cell,2011；144(4):513-25.

〔2016-01-17修回〕

(编辑袁左鸣)

Activation of DKKL1 expression by hypoxia in human OSCC cell lines

WANG Jian-Qiu,FAN Ru-Yi,XIE Qi-Yang,et al.

Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Medicine,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,Zhejiang,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of tumor hypoxia microenvironment on expression of DKKL1 in oral squamous cell carcinoma(OSCC)cells lines and explore its potential epigenetic mechanism.MethodsTwo kinds of human OSCC cell lines in exponential growth phase,SAS and OECM-1 cells,were cultured in normoxia or hypoxia(1.0% oxygen)conditions for 18 h.Both Real-time PCR and Western blot were applied to detect the change of DKKL1 expression.Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)experiments were performed to detect the changes of histone modification of acetylated or dimethyl H3K4(H3K4ac/H3K4me2)on DKKL1 gene promoter.ResultsCompared to normoxic conditions,hypoxia(1.0%)significantly increased the expression of DKKL1 in both SAS and OECM-1 cells,and the relative mRNA level was (4.0±0.4)folds and(2.4±0.1)folds of that under normoxia in SAS(P<0.01)or OECM-1(P<0.01)cells,respectively.ChIP experiments showed that level of H3K4ac on promoter of DKKL1 gene was increased,while the level of H3K4me2 was reduced significantly.ConclusionsHypoxia activates the expression of DKKL1,which may be related with the regulation of hypoxia on histone modification of H3K4ac and H3K4me2 on the promoter of DKKL1 gene.

【Key words】Oral squamous cell carcinoma; Hypoxia; DKKL1; Histone modification

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81301850)；浙江省教育厅科研项目(No.Y201328812)

通讯作者：闫风琴(1978-)，女，主治医师，主要从事头颈癌放射治疗的研究。

〔中图分类号〕R739.8

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2569-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.001

1浙江省肿瘤医院放疗科十九病区

第一作者：王建秋(1979-)，男，助理研究员，主要从事肿瘤与衰老的研究。