薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞因子表达水平及其免疫功能的影响

吴奕征　孙叶丹　陆建红　陈国军　董长林

(浙江大学医学院临床医学系，浙江　杭州　310029)

薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞因子表达水平及其免疫功能的影响

吴奕征孙叶丹1陆建红2陈国军2董长林2

(浙江大学医学院临床医学系，浙江杭州310029)

〔摘要〕目的探讨薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞因子表达水平及其免疫功能影响。方法选择健康雄性Wistar大鼠，采用Ⅱ型胶原蛋白及弗氏完全佐剂建立大鼠胶原性关节炎模型，随机分为对照组、模型组、药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(分别为30.0、60.0、120.0 mg/kg薯蓣皂苷)，每组10只，第14天开始灌胃给药，第35天处死大鼠，无菌取大鼠腹腔巨噬细胞测定其吞噬功能，测定白细胞介素(IL)-1水平，脾细胞分泌因子IL-2水平，PCR测定腹腔巨噬细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA表达水平。结果与模型组比较，薯蓣皂苷药物组可显著抑制关节肿胀度(P<0.05)，减轻关节病理组织损伤，呈现一定剂量依赖性；与模型组比较，药物组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能下降，IL-1及脾细胞IL-2分泌水平下降，TNF-α mRNA表达水平降低(P<0.05)，呈现一定剂量依赖性。结论薯蓣皂苷可显著抑制胶原性关节炎大鼠关节炎症程度，改善病理组织损伤，其作用机制可能与降低大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，下调炎症因子分泌表达水平相关。

〔关键词〕薯蓣皂苷；巨噬细胞；免疫功能；TNF-α

目前对于类风湿关节炎的病因及发病机制尚未完全阐明，尚无较好根治方法〔1〕。薯蓣皂苷为薯蓣科植物穿山龙薯蓣根茎提取物，具有抗血栓形成、抗肿瘤、抗感染、抗过敏、抗病毒、降低胆固醇等多种药理作用〔2〕。近年来研究结果显示〔3〕，薯蓣皂苷具有较强抗炎作用，可抑制胶原性关节炎大鼠足趾肿胀，可通过抑制核转录因子(NF)-κB活性，降低血管生成因子表达水平，下调关节软骨环氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2表达水平，可用于治疗类风湿关节炎。本研究旨在探讨薯蓣皂苷对腹腔巨噬细胞吞噬功能及细胞因子表达水平的影响。

1材料与方法

1.1实验动物选择健康雄性Wistar大鼠，体重120～140 g，由中国医学科学院动物实验中心提供(许可证号：SYXK-2013-0025)，SPF级动物实验室，饮食进水均符合实验动物标准。

1.2试验药物与试剂薯蓣皂苷(单体，购自美国Sigma公司，纯度95%)采用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(购于南京建成生物工程研究所)配置相应浓度，现用现配，鸡Ⅱ型胶原蛋白及弗氏完全佐剂(购于美国Sigma公司)，中性红(购于美国Sigma公司)，肿瘤坏死因子(TNF)-α逆转录试剂盒(购于Promega公司)。

1.3实验方法

1.3.1动脉模型建立〔4〕取Ⅱ型胶原蛋白溶于冰乙酸(0.1 mol/L)制成2 g/L溶液，4℃搅拌过夜后等体积与弗氏完全佐剂1 g/L溶液混合乳化，制成混悬乳剂(浓度1 g/L)。分别于第0、7天大鼠背部皮内注射1 ml混悬乳剂(每次6个点)，对照组大鼠注射等量生理盐水。造模14 d后选取关节评分>2分的大鼠，随机分为模型组、药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(30.0、60.0、120.0 mg/kg薯蓣皂苷)，每组10只，第14天开始灌胃给药，对照组、模型组的大鼠给予等量CMC-Na，药物组大鼠给予相应剂量药物，第35天处死大鼠。

1.3.2大鼠足肿胀度测定大鼠造模第7、14、21、28、35天测定体重及左后足爪容积(足爪仪)，足肿胀度=致炎后足爪容积-致炎前足爪容积。

1.3.3病理组织学观察取大鼠膝关节用中性甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察。

1.3.4大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定参考文献〔5〕方法制备大鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度为1×109/L(RPMI-1640培养液)，中性红试验测定巨噬细胞吞噬功能〔6〕，酶标仪测定吸光度A。

1.3.5脾淋巴细胞因子表达水平制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×109/L，加入3 mg/L刀豆蛋白诱导淋巴细胞分泌(IL)-2，采用脾淋巴细胞增殖法测定脾细胞因子IL-2水平〔7〕。

1.3.6巨噬细胞IL-1、TNF-α mRNA表达水平参考文献方法制备大鼠腹腔巨噬细胞〔5〕，调整细胞浓度为1×109/L，采用胸腺细胞增殖法测定巨噬细胞因子IL-1水平〔8〕，PCR测定腹腔巨噬细胞中TNF-α mRNA表达水平。引物由上海生物技术公司提供，重复循环30个：94℃变性40 s，54℃ 40 s、72℃1 min。采用Eagle eye TMⅡ型图像分析系统扫描，TNF-α mRNA相对表达量=TNF-α吸光度/β-actin吸光度。TNF-α引物：片段长度426 bp，上游5′-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3′，下游5′-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′；β-actin引物：片段长度543 bp，

上游5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游5′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′。

1.4统计学方法采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析和LSD检验。

2结果

2.1薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠足肿胀的影响与对照组比较，模型组大鼠7 d后体重增长缓慢，造模后14 d出现关节炎症，药物组大鼠足肿胀有不同程度减轻(P<0.05)，体重有不同程度增加。见图1。

2.2薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠病理组织损伤的影响对照组大鼠滑膜组织细胞排列整齐，软骨表面光滑；模型组大鼠滑膜组织上皮细胞纤维化，细胞炎性浸润增生，软骨损伤。药物组炎性细胞浸润不同程度减轻，增生减少。见图2。

A～E：分别为对照组、模型组、药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组图1　薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠体重、足肿胀影响

图2　薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠病理组织损伤的影响(HE，×200)

2.3薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及细胞因子的影响与对照组比较，模型组巨噬细胞吞噬功能升高，IL-1、IL-2水平增加，TNF-α mRNA表达上调，药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠吞噬吞噬功能不同程度降低(P<0.05)，IL-1、IL-2水平及TNF-α mRNA表达受到不同程度抑制，呈现一定剂量依赖性。见表1。

表1　薯蓣皂苷对胶原性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与药物Ⅰ组比较：3)P<0.05；与药物Ⅱ组比较：4)P<0.05

3讨论

胶原性关节炎模型与佐剂性关节炎模型均为免疫性炎症模型，与佐剂性关节炎模型比较，胶原性关节炎模型免疫功能变化表现在细胞免疫及体液免疫，与人类类风湿关节炎更接近，为筛选抗类风湿关节炎常用有效模型〔9〕。薯蓣皂苷具有多种药理活性，近年来研究表明薯蓣皂苷对于胶原性关节炎大鼠有较强抗感染作用，可抑制小鼠耳廓肿胀及减轻小鼠扭体反应，减轻佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织增生及关节软骨损伤，降低炎性细胞浸润，可通过抑制NF-κB信号转导途径及JAK-STAT信号转导途径，降低血管生成因子表达水平，下调关节软骨COX-2、PGE2表达水平〔10〕。机体免疫系统损伤后可导致癌症、感染及自身免疫疾病，类风湿关节炎为由免疫系统介导的炎症性疾病。本研究提示薯蓣皂苷可明显治疗胶原性关节炎。

免疫系统受到特殊抗原及自身抗体刺激时，炎症介质主要来源于活化的巨噬细胞，在类风湿关节炎病变过程中巨噬细胞产生的炎性介质发挥重要作用，早期感染阶段，巨噬细胞通过吞噬作用发挥非特异性免疫，活化巨噬细胞分泌促炎细胞因子〔11，12〕。关节软骨分解代谢过程中IL-1、TNF-α具有重要作用，可通过上调诱导酶、细胞基质金属蛋白酶等表达破坏软骨基质，下调软骨基因表达连接蛋白、Ⅱ型胶原等抑制合成软骨基质；IL-1与滑膜细胞纤维化及血管内皮细胞增殖等因素有关，TNF-α主要促进炎症反应，可诱导产生IL-1，而IL-1可增加TNF-α活性〔11，12〕。抑制TNF-α、IL-1水平可减轻炎症程度；IL-2可反映细胞免疫功能。本研究结果提示薯蓣皂苷抗感染与调节免疫功能与下调细胞因子TNF-α、IL-1、IL-2表达水平相关。

4参考文献

1Chen Y，Xu X，Zhang Y，etal.Diosgenin regulates adipokine expression in perivascular adipose tissue and ameliorates endothelial dysfunction via regulation of AMPK〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2016；155(PtA)：155-65.

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3Ebrahimi H，Badalzadeh R，Mohammadi M，etal.Diosgenin attenuates inflammatory response induced by myocardial reperfusion injury：role of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels〔J〕.J Physiol Biochem，2014；70(2)：425-32.

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11Jung DH，Park HJ，Byun HE，etal.Diosgenin inhibits macrophage-derived inflammatory mediators through downregulation of CK2，JNK，NF-kappaB and AP-1 activation〔J〕.Int Immunopharmacol，2010；10(9)：1047-54.

12Huang CH，Liu DZ，Jan TR.Diosgenin，a plant-derived sapogenin，enhances regulatory T-cell immunity in the intestine of mice with food allergy〔J〕.J Nat Prod，2010；73(6)：1033-7.

〔2015-07-10修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：陆建红(1969-)，女，副主任技师，主要从事临床医学检验及细胞形态学分析方面的研究。

〔中图分类号〕R.593.21

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2607-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.017

1浙江省食品药品检验研究院2武警浙江总队嘉兴医院检验科

第一作者：吴奕征(1994-)，男，在读本科，主要从事临床医学及实验诊断研究。