补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠海马晚期糖基化终产物受体的影响

周忠光　费洪新

(黑龙江中医药大学，黑龙江　哈尔滨　150040)

补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠海马晚期糖基化终产物受体的影响

周忠光费洪新1

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

〔摘要〕目的探讨补阳还五汤(BYHWD)对阿尔茨海默病(AD)小鼠海马晚期糖基化终产物受体(RAGE)的影响。方法选用30只APP/PS1转基因小鼠，随机分成模型组，治疗组(多奈哌齐0.001 g/kg)，BYHWD高、中、低剂量组(BYHWD 37.06、18.53、9.26 g/kg)，另选6只C57BL/16J小鼠分为对照组，各组连续治疗35 d后取材。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定海马APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40水平，采用HE染色和尼氏染色观察各组小鼠海马CA1区神经元组织形态病理改变，采用免疫组化检测海马RAGE表达，采用RT-PCR和Western印迹检测海马RAGE、VCAM和ICAM-1 基因和蛋白表达。结果与模型组比较，BYHWD高、中剂量组可明显改善海马形态结构，明显降低海马APP、Aβ1～42和Aβ1～40水平，明显升高血清Aβ1～40水平(P<0.05)，明显降低海马RAGE、VCAM和ICAM-1 基因和蛋白表达 (P<0.05)。结论BYHWD通过抑制RAGE表达来改善AD小鼠海马的形态结构。

〔关键词〕补阳还五汤；阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)发病与β淀粉样蛋白(Aβ)沉积〔1〕和血脑屏障(BBB)功能异常〔2〕等有关。Aβ来源于β淀粉样前体蛋白(APP)，毛细血管内皮细胞上存在晚期糖基化终产物受体(RAGE)〔3〕，RAGE 与Aβ结合，介导Aβ转运进入脑组织〔4,5〕。在AD中，RAGE与血管内皮黏附因子(VCAM)和细胞间黏附因子(ICAM)-1表达相关〔6,7〕，使用RAGE抑制剂后VCAM表达下调〔8〕。本课题前期工作显示，补阳还五汤(BYHWD)可改善AD小鼠学习记忆〔9,10〕，减少海马细胞凋亡〔11〕，改善海马结构〔12〕，降低BBB通透性〔13〕，下调海马核因子(NF)-κBp65表达〔14〕等，但是BYHWD对AD转基因小鼠RAGE的研究国内外尚无文献报道。基于此，本研究探讨BYHWD对APP/PS1转基因小鼠海马RAGE基因和蛋白的影响。

1材料和方法

1.1实验动物7月龄雄性清洁级APP/PS1转基因小鼠30只(哈尔滨医科大学吴树亮教授赠送)，体重(23±2)g；野生型C57BL/6J小鼠6只(北京维通利华实验动物技术公司)，动物生产合格证号：SCXK(京)2012-0001。小鼠按照清洁级标准常规饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心。

1.2试剂和药品RAGE(Boster，ba-1789)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)；APP、Aβ1～42和Aβ1～40酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20140401)；VCAM和ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnology)；RNeasy@Mini Kit(美国QIAGEN公司)；盐酸多奈哌齐片(中国重庆植恩药业有限公司)；BYHWD包括黄芪120 g(131109)、当归尾6 g(131001)、赤芍4.5 g (121003)、川芎3 g(20140501)、地龙3 g(121002)、桃仁3 g(20140401)和红花3 g(130901)，均购买于黑龙江中医药大学附属第一医院，由本校实验中心田明教授制备成干粉，-80℃冰箱中保存。

1.3主要仪器Applied Biosystems step one plus定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；CM1900型冰冻切片机(德国Leica公司)；BMJ-B型包埋机(常州市中威电子仪器有限公司)；E600型尼康显微镜(日本尼康公司)；HHS型水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)等。

1.4方法

1.4.1基因鉴定实验剪取APP/PS1转基因小鼠的鼠尾0.5 cm，设计APP基因和PS1基因引物。APP：正义引物：5′-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3′，反义引物：5′-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3′；PS1：正义引物：5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′，反义引物：5′-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3′，按照试剂盒说明书操作，采用PCR法获得电泳图并拍照。

1.4.2分组与给药30只APP/PS1转基因小鼠随机分为模型组(予生理盐水)，治疗组(多奈哌齐0.001 g/kg)，BYHWD高、中、低剂量组(37.06、18.53、9.26 g/kg)，每组6只。6只野生型C57BL/6J小鼠为对照组(予生理盐水)，各组小鼠持续灌胃给药35 d。

1.4.3ELISA方法实验结束后，各组小鼠眼球采血，匀浆，静置；另取海马，匀浆，静置，将血清和海马匀浆液4 000 r/min离心15 min，取上清液，分装，-80℃保存。在酶标仪上450 nm波长处测定吸光度(A)，绘制标准曲线，求得海马APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40。

1.4.4苏木素-伊红(HE)染色实验结束后，小鼠水合氯醛麻醉，左心室灌注100 ml生理盐水，然后用4%多聚甲醛缓慢匀速灌注，脑固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，制备石蜡切片，经过常规HE染色过程，光学显微镜观察海马CA1区结构。

1.4.5尼氏体染色实验结束后，小鼠麻醉，左心室灌注100 ml生理盐水，4%多聚甲醛灌注100 ml，取脑放于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，制备石蜡切片，经过二甲苯脱蜡处理，下行梯度乙醇脱水，1%焦油紫染色，上行梯度乙醇脱水，二甲苯处理，中性树胶封片，用E600型尼康显微镜观察小鼠海马CA1区。

1.4.6免疫组织化学采用SP法开始实验，石蜡切片脱蜡、H2O2处理、滴加一抗和二抗、DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片等过程。400倍显微镜计数棕色细胞的阳性目标数，采用HMIAS高清晰度彩色医学图文系统分析。

1.4.7实时定量PCR实验结束后，取材小鼠脑海马，按照Trizol试剂盒方法提取海马总RNA，反转录成cDNA，PCR扩增。设计引物：RAGE：正义：5′-AAA ACG ACA ACC CAG GCG T-3′，反义：5′-ATT CTC TGG CAT CTC CGC TTC-3′；VCAM：正义：5′-TGT GAA GAT GGT CGC GAT CTT-3′，反义：5′-CAA TCT GAG CGA GCG TTT TGT-3′；ICAM-1：正义：5′-ACC ACG GAG CCA ATT TCT CAT-3′，反义：5′-AAG ATC GAA AGT CCG GAG CTG-3′；β-actin：正义：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，反义：5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′。引物由中国上海捷瑞生物工程有限公司合成，设置PCR参数：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，分析实验数据，采用2-ΔΔCt法计算RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA。

1.4.8Western印迹实验结束后，取小鼠海马，按照Western印迹说明书操作，加裂解液，匀浆，4℃ 12 000 r/min离心10 min，测定蛋白浓度，100℃变性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加一抗、二抗，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值评价RAGE、VCAM和ICAM-1表达。

1.5统计学分析采用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1基因鉴定APP/PS1转基因小鼠可检测到APP基因与PS1基因同时表达；野生型C57BL/6J小鼠未检测到APP基因与PS1基因同时表达。见图1。

M：分子量Marker；2、4、5、7为APP/PS1转基因小鼠；1、3、6为野生型C57BL/6J小鼠图1　APP与PS1基因电泳图(PCR法)

2.2ELISA检测与对照组比较，模型组小鼠海马APP、Aβ1～42和Aβ1～40明显增加且血清Aβ1～40明显降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗组及BYHWD高、中剂量组小鼠海马APP、Aβ1～42和Aβ1～40明显降低且血清Aβ1～40明显升高(P<0.05)，而低剂量组小鼠海马APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40改变不明显(P>0.05)。见表1。

表1　海马APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.3HE染色对照组小鼠海马CA1区锥体细胞呈多边形，3～5层、细胞较大，染色均匀；模型组小鼠海马CA1区锥体细胞数量较少，2～3层，分散排列；治疗组、高剂量组和中剂量组小鼠海马CA1区锥体细胞数量较多，3～4层，排列比较紧密，细胞核清晰；低剂量组海马CA1区锥体细胞较小，染色浅，2～3层。见图2、图3。

2.4尼氏体染色对照组小鼠海马CA1区锥体细胞尼氏体丰富，染色深；模型组小鼠海马CA1区锥体细胞尼氏体染色浅，尼氏体数量较少；治疗组，BYHWD高、中、低剂量组小鼠海马CA1区锥体细胞尼氏体丰富，染色较深。见图4、图5。

2.5免疫组织化学检测RAGE主要表达于小鼠海马神经元细胞膜和细胞质内。与对照组〔(16.83±2.23)个〕比较，模型组海马RAGE〔(35.33±4.46)个〕阳性目标数明显增加(P<0.05)；与模型组〔(35.33±4.46)个〕比较，治疗组〔(24.50±4.18)个〕、高剂量组〔(23.17±4.07)个〕、中剂量组〔(17.33±3.50)个〕海马RAGE阳性目标数明显降低(P<0.05)，而低剂量组(31.83±2.14)个海马RAGE阳性目标数改变不明显(P>0.05)。见图6、图7。

2.6实时定量PCR测定与对照组比较，模型组海马RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组、高剂量组和中剂量组海马RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA明显降低(P<0.05)，而低剂量组海马RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA改变不明显(P>0.05)。见表2。

图2　海马CA1区 (HE，×100)

图3　海马CA1区 (HE，×400)

图4　海马CA1区 (尼氏体染色，×100)

图5　海马CAI区(尼氏体染色，×400)

图6　海马RAGE表达 (免疫组化染色，×100)

图7　海马RAGE表达(免疫组化染色，×400)

组别RAGEVCAMICAM-1对照组1.01±0.151.02±0.241.07±0.44模型组1.69±0.211)2.10±0.411)2.21±0.621)治疗组1.05±0.192)1.22±0.442)1.26±0.512)高剂量组1.17±0.462)1.34±0.312)1.37±0.552)中剂量组1.07±0.262)1.60±0.372)1.50±0.532)低剂量组1.51±0.261.81±0.381.89±0.30

2.7Western印迹测定RAGE、VCAM和ICAM-1蛋白表达与对照组比较，模型组海马RAGE、VCAM和ICAM-1明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组、高剂量组和中剂量组海马RAGE、VCAM和ICAM-1明显降低(P<0.05)，而低剂量组海马RAGE、VCAM和ICAM-1改变不明显(P>0.05)。见表3，图8。

表3　RAGE、VCAM和ICAM-1蛋白表达

1.对照组；2.模型组；3.治疗组；4.高剂量组；5.中剂量组；6.低剂量组图8　RAGE、VCAM和ICAM-1表达

3讨论

AD病变主要集中在海马、皮质等〔15〕，海马CA1区与学习记忆关联较大〔16〕。本实验模型组小鼠海马CA1区尼氏体数量减少，说明蛋白质合成功能减弱，模型稳定。经过治疗后，BYHWD高、中剂量组海马结构逐渐恢复，说明BYHWD可改善AD小鼠海马结构。

Aβ主要分为Aβ1～42和Aβ1～40，Aβ1～42形成老年斑(SP)，Aβ1～40可经过BBB转运进入脑组织，加重AD。本实验显示模型组海马Aβ1～40增加，而血清Aβ1～40降低，说明Aβ1～40经过某种机制进入了脑组织，加重AD。治疗后，海马Aβ1～40降低且血清Aβ1～40增加，说明BYHWD可通过某种机制将脑海马Aβ1～40外排进入血液中，减缓AD的发生发展。

为了进一步明确海马Aβ1～40与血清Aβ1～40的关系，本实验测定了RAGE、VCAM和ICAM-1基因和蛋白的表达。结果显示，模型组RAGE、VCAM和ICAM-1基因和蛋白表达上调，RAGE-Aβ1～40复合体增加，加速Aβ1～40进入脑组织，促进了Aβ1～42的成熟，增加SP的形成。经过治疗后，RAGE、VCAM和ICAM-1基因和蛋白表达下调，RAGE-Aβ1～40复合体减少，减少Aβ1～40进入脑组织，减缓Aβ1～42成熟，从而减缓AD发生发展。

本实验显示海马RAGE的变化趋势与海马Aβ1～40及血清Aβ1～40变化趋势密切相关。经过BYHWD治疗后，出现降低海马Aβ1～40、增加血清Aβ1～40和改善海马神经元结构等现象，说明BYHWD可通过影响RAGE及下游蛋白表达来改善海马Aβ1～40的含量及其海马形态结构。

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〔2015-08-12修回〕

(编辑袁左鸣)

The effects of Buyang Huanwu decoction on advanced glycation end product receptor of hippocampus in Alzheimer′s disease mice

ZHOU Zhong-Guang，FEI Hong-Xin.

Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of Buyang Huanwu decoction(BYHWD) on advanced glycation end product receptor(RAGE) of hippocampus in Alzheimer′s disease(AD) mice.MethodsThe APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into control，model，treatment (Donepezil 0.001 g/kg)，BYHWD high-dose (37.06 g/kg)，BYHWD medial-dose (18.53 g/kg), BYHWD low-dose groups (9.26 g/kg).The levels of APP, Aβ1～42and Aβ1～40in the hippocampus and Aβ1～40in the serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). HE staining and Nissl′s staining were used to observe pathological changes of morphology in mice hippocampus CA1 area. Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of RAGE in the hippocampus. The content levels of RAGE mRNA and RAGE protein in the hippocampus were determined by RT-PCR and Western bolt.ResultsCompared with those of model group，the expressions of APP, Aβ1～42and Aβ1～40in the hippocampus were significantly decreased in BYHWD high-dose and BYHWD medial-dose groups(P<0.05)，the expressions of Aβ1～40in the serum were significantly increased(P<0.05). BYHWD high-dose and medial-dose maintained brain normal morphological structure of nerve cells, and the expressions of RAGE, VCAM and ICAM-1 genes and protein expressions were decreased significantly compared with those of AD model group(P<0.05).ConclusionsBYHWD could maintain normal morphological structure of nerve cells of AD mice. BYHWD plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting RAGE.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Alzheimer′s disease

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81373777，81173599)；高校博士学科点科研基金 (博导类，20132327110010)

通讯作者：费洪新(1978-)，男，讲师，博士，博士后，主要从事痴呆、痛风、肿瘤研究。

〔中图分类号〕R285

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2593-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.011

1齐齐哈尔医学院

第一作者：周忠光(1957-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事痴呆、痛风、肿瘤研究。