冻融胚胎移植妊娠结局的影响因素分析

王伟周，魏德莉，沈玉良，吴迪，王蔼明

(中国人民解放军海军总医院，北京　100048)

冻融胚胎移植妊娠结局的影响因素分析

王伟周#，魏德莉#，沈玉良，吴迪，王蔼明*

(中国人民解放军海军总医院，北京100048)

【摘要】目的探讨患者年龄、子宫内膜准备方案、移植胚胎数、胚胎的发育潜能和胚胎完整性对冻融胚胎移植(FET)妊娠结局的影响。方法选择2012 年2 月至2014 年12月在海军总医院生殖中心接受FET治疗的1 346 例患者，1 346个FET周期。按年龄<30岁、30～<35岁、35～<40岁、≥40岁分为A、B、C、D四组；根据移植前不同子宫内膜准备方案分为：自然周期(N组)、人工周期(H组)和促排周期(S组)；根据移植胚胎数2、3枚分为E、F两组；根据解冻胚胎继续培养后卵裂球是否分裂生长，每个 FET 周期所移植胚胎中进一步卵裂的胚胎个数n，并据此分为 I(n=0)，II(n=1)，III(n=2或3)三组；根据复苏后移植胚胎卵裂球的完整性分为两组：完整组和受损组。分别比较各组的妊娠结局。结果年龄方面，A组、B组、C组的妊娠率和着床率均高于D组，差异均具有统计学意义(P<0.01)；自然周期、人工周期及促排周期3种子宫内膜准备方案，妊娠率和种植率三组间两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)；移植2枚或3枚胚胎，对妊娠结局(妊娠率45.56% vs. 45.02%)影响不大(P >0.05)，但两组着床率(26.07% vs. 17.40%)有显著性差异(P<0.05)；胚胎解冻后继续培养，随着进一步卵裂胚胎数目的增加，妊娠率(分别为25.27%、39.29%、52.37%)和着床率(分别为10.74%、19.79%、29.16%)均有逐渐升高的趋势，且三组的妊娠率和着床率两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)；胚胎完整组的妊娠率略高于胚胎受损组(45.08% vs.40.15%)，但无统计学差异(P >0.05)，而相比较，胚胎完整组着床率显著高于胚胎受损组(24.65% vs. 18.85%，P<0.05)。结论移植前不同的子宫内膜准备方案对妊娠结局无显著影响；移植2枚或3枚胚胎对妊娠结局影响不大；年龄和卵裂球的完整性是影响FET成功的重要因素；冻融胚胎提前解冻并培养后，选择进一步卵裂的胚胎进行移植有助于提高妊娠率和着床率。

【关键词】冻融胚胎移植；年龄；卵裂球生长；妊娠率；着床率

Methods： A total of 1 346 cases of FET cycles were divided into series of groups based on different factors：Factor 1：age (≤29，30-34，35-39 and ≥40 years groups，i.e. group A，B，C，D)；Factor 2：endometrial preparation protocols [natural cycle (group N)，artificial cycle (group H) and super ovulation cycle (group S)]；Factor 3：transferred embryos number (2，3，i.e. group E，F)；Factor 4：number of merogenic embryos (0，1，≥2，i.e. group I，II，III)；Factor 5：integrity of the blastomeres of transfer embryo after thawed，intact group (all the transferred embryos with fully intact blastomeres) and damaged group (the transferred embryos with less than 50% damaged blastomeres).

Results： In the age groups，the average pregnancy rate (APR) and implantation rate (IR) of group A，B and C were all significant higher than those of group D (P<0.01). There were no significant differences in APR and IR among natural cycle (group N)，hormonally manipulated artificial programmed cycle (group H) and hormonally manipulate stimulated cycle (group S)(P>0.05). There was no difference in pregnancy (45.56% vs. 45.02%)when two embryos or three embryos were transferred，however，implantation rate of group E was significantly higher than group F(26.07% vs. 17.40%)(P<0.05). Our results also indicated that the blastomere growth was a significant factor on success of transfer. The more the number of merogenic embryos was，the higher pregnancy rate(25.27%，39.29% and 52.37%，respectively) and implantation rate (10.74%，19.79% and 29.16%，respectively)were. The significant differences were found among group I，II and II(P<0.01). Furthermore，the damage embryos group had a slight lower pregnancy rate(40.15% vs. 45.08%，P>0.05)and a significantly lower implantation rate(18.85% vs. 24.65%，P<0.05)compared with the intact embryos group.

Conclusions： The transplantation endometrial preparation protocols have no significant effect on the success of frozen-thawed embryos. The numbers of transferred embryos have little effect on the outcome of pregnancy. Age and blastomere integrity are significant influencing factors on pregnancy outcome in FET cycles. Selection of the cryopreserved embryos with further cleavage after frozen-thawed increases pregnancy rate and implantation rate.

(JReprodMed2016，25(6)：517-521)

冻融胚胎移植(FET)技术目前已成为IVF-ET的常规治疗方案，该技术可以减少卵巢过度刺激综合征(OHSS)，降低多胎妊娠率、促排卵次数及患者费用，提高IVF的累积妊娠率[1]。自1983年世界上首例冻融胚胎成功妊娠报道以来[2]，FET技术已广泛应用于临床。然而，从目前发表的文章中发现，与新鲜周期胚胎移植相比，FET的临床妊娠率偏低。因此，有必要对FET的影响因素作进一步研究，以提高FET的临床妊娠率。本研究回顾性分析海军总医院生殖中心1 346例FET患者的临床资料，探讨患者年龄、子宫内膜准备方案、移植胚胎数、胚胎的发育潜能和胚胎完整性对FET妊娠结局的影响。

资料与方法

一、临床资料及分组

选择2012 年2 月至2014 年12月在海军总医院生殖中心接受FET治疗的1 346 例患者，年龄21～45 岁。新鲜周期胚胎，经患者夫妇同意将其予以冻存。根据形态学参数，卵裂期胚胎分为以下四级：Ⅰ级：卵裂球≥8个，卵裂球均匀、细胞质均一、无空泡，碎片≤5%；Ⅱ级：卵裂球≥6个，卵裂球均匀或略不均匀，细胞质均一、无空泡，碎片占5%～15%；Ⅲ级：卵裂球≥6个，同时卵裂球明显不均匀，细胞质中有少量空泡，碎片15%～30%；Ⅳ级：卵裂球≤6个，卵裂球明显不均匀、细胞质不均一、或有大量空泡，碎片占30%～50%。其中Ⅰ级和Ⅱ级为优质胚胎；Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级为可移植/可冻融胚胎。

分组：患者按年龄分为A(<30岁)、B(30～<35岁)、C(35～<40岁)、D(≥40岁)四组；根据FET内膜准备方案分为：自然周期(N组)、人工周期(H组)和促排周期(S组)；根据移植胚胎数目分为 E(2枚)、F(3枚)两组；根据解冻胚胎继续培养后卵裂球是否分裂生长，每个 FET 周期所移植胚胎中进一步卵裂的胚胎个数(n)，分为 I(n=0)、II(n=1)、III(n=2或3)三组；根据FET胚胎卵裂球的完整性分为：完整组(FET胚胎卵裂球均完整，无损伤)和受损组(FET卵裂球部分损伤，损伤率<50%)。

二、研究方法

1.FET内膜准备方案：(1)自然周期：月经规律且排卵正常患者，阴道超声监测卵泡生长及子宫内膜厚度，直到成熟卵泡消失，排卵当天进行子宫内膜转化，排卵后第3天进行冻融胚胎移植；(2)人工周期：月经不规律，及自然周期卵泡生长欠佳或无排卵的患者，自月经第3～4天始口服补佳乐(广州拜耳)，剂量为4～8 mg/d，至内膜生长至较理想厚度(≥8 mm)时进行子宫内膜转化，转化后第3 天进行冻融胚胎移植；(3)促排卵周期：卵泡发育欠佳，排卵障碍患者，自月经第3～5天给予HMG 75～150 U/d，直至卵泡成熟，适时肌肉注射HCG(珠海丽珠)5 000～10 000 U，监测至排卵日按照自然周期转化内膜。

2.胚胎解冻：移植前1 d下午进行胚胎复苏，检查胚胎透明带完整性、卵浆的透亮程度，如有 50% 以上卵裂球受损，则解冻其他胚胎，体外培养至次日(约18 h)移植。胚胎解冻：使用MEDICULT胚胎解冻液包(Warming-Kit，Origio，丹麦)。将载有胚胎的冷冻载杆从液氮中取出后直接浸入置于37℃预热的WS1(Warming Solution 1)液中平衡1 min，然后将胚胎依次转入WS2、WS3和WS4液中各平衡3 min，最后将胚胎移入胚胎培养液(COOK，美国)中，并放入37℃、6% CO2饱和湿度桌面培养箱内培养。

3. 胚胎移植：移植前嘱咐患者多饮水，充盈膀胱，移植时患者仰卧于移植床上，常规清洁外阴及阴道，阴道窥器暴露宫颈去除宫颈黏液。在腹部超声引导下，根据内膜形态及厚度，将载有胚胎的移植管(COOK，美国)的内管顶端送至宫腔中或中下段，缓慢注入装有胚胎的移植液至子宫腔，推注完毕停留约5～10 s，缓慢退出内管。移植管送实验室检查，确定无胚胎遗留后，完成移植。术后患者平卧休息1 h左右。

4.妊娠标准：自移植日始10～14 d后采血测β-HCG，判断妊娠情况，将血β-HCG > 30 U/L定义为妊娠。移植后5～6周超声检查，有孕囊及原始心管搏动即诊断为临床妊娠。妊娠囊数除以移植胚胎数为着床率。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料以率(%)表示，各组间妊娠率比较采用卡方(χ2)检验进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

一、年龄对冻融胚胎移植妊娠结局的影响

A组、B组、C组之间妊娠率和着床率均无显著性差异(P均>0.05)，但均高于D组，差异均具有统计学意义(P<0.01)(表1)。

注：与D组相比，*P<0.01

二、不同子宫内膜准备方案对冻融胚胎移植妊娠结局的影响

自然周期(N)、人工周期(H)及促排周期(S)3种子宫内膜准备方案，妊娠率和种植率3组间两两比较，均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2　不同子宫内膜准备方案对冻融胚胎

三、移植胚胎数对冻融胚胎移植妊娠结局的影响

移植2枚胚胎组(E组)的妊娠率(45.56%)和移植3枚胚胎组(F组)的妊娠率(45.02%)之间无统计学差异(P>0.05)；两组着床率分别是26.07%和17.40%，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3　移植胚胎数对冻融胚胎妊娠结局的影响

注：与E组比较，*P<0.05

四、冻融胚胎进一步卵裂对冻融胚胎移植妊娠结局的影响

胚胎解冻后继续培养，随着进一步卵裂胚胎数目的增加，妊娠率(分别为25.27%、39.29%、52.37%)和着床率(分别为10.74%、19.79%、29.16%)均有逐渐升高的趋势，且3组的妊娠率和着床率两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)(表4)。

表4　冻融胚胎进一步卵裂数目对妊娠结局的影响

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组两两相比，*P<0.01

五、胚胎完整性对冻融胚胎移植妊娠结局的影响

胚胎完整组的妊娠率高于胚胎受损组(分别为45.08%、40.15%)，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)；而两组的着床率相比较，胚胎完整组高于胚胎受损组，差异具有统计学意义(P<0.05)(表5)。

表5　胚胎完整性对冻融胚胎妊娠结局的影响

注：与胚胎受损组相比，*P<0.05

讨论

自1994年我国完成首例冻融胚胎移植(FET)妊娠以来[3]，该技术在国内得以飞速发展。FET是辅助生殖技术(ART)的重要内容，研究表明，FET可以通过减少卵巢过度刺激综合征的发生来提高累积妊娠率[4]，并且还能最大限度地减少移植胚胎的个数。目前，FET已广泛被临床医学所采用。但是，由于技术层面和患者自身健康等条件的制约，尚不能确保每一次的成功率。

但是，胚胎在经历冻融的强烈刺激之后，具有发育潜能的卵裂球数目会减少，并会与准备的子宫内膜不同步，最终难以获得较好临床妊娠率。张洪秀等[5]发现对冷冻前分裂速率较慢胚胎提前一日复苏，相比当日复苏的可提高临床妊娠率和种植率。本研究发现：随着胚胎复苏后进一步卵裂胚胎数目的增加，临床妊娠率和着床率就愈高，且各组间差异显著，这与之前的研究报道一致[6]。说明冻融胚胎复苏后，有丝分裂的恢复以及进一步卵裂球数目的增多是影响妊娠成功率的关键因素。因此，我们认为适当提前进行胚胎复苏并观察复苏后有效卵裂球数目，可能是临床中提高妊娠率和着床率的重要措施之一。

目前，很多研究已证明年龄是衡量IVF活产率的一个重要的因素[7]。早在1990年，Piette等[8]就已对IVF中妇女的年龄因素进行了研究，发现高龄妇女(>40岁)的妊娠成功率显著降低。Check等[9]将患者分成三组(<35岁，36～39岁和40～42岁)，发现前两组的临床妊娠率没有显著差异，而40～42岁组则显著降低；对于种植率来说，年轻组更好。本研究中，发现随着年龄的增长，临床妊娠率和着床率均呈现下降趋势。与Check等[9]的研究类似，年龄40岁以下时，各组之间并没有显著差异，而40岁以上明显下降。随着年龄的增长，卵巢储备能力和子宫内膜容受性下降，胚胎非整倍性增加，染色体等异常导致胎儿发育异常，最终引发流产[10]。因此，年龄是造成高龄孕妇低妊娠率的一个很重要因素。

FET前子宫内膜准备方案有自然周期、人工周期和促排卵周期。自然周期符合人体生理状态，避免了使用外源性激素，符合胚胎着床的生理要求，同时可以减轻患者的经济负担，但其监测频繁、时机不易掌握。人工周期通过使用外源性激素药物进而改善内分泌激素水平来模拟自然状态准备内膜，促使子宫内膜的增厚及转化，监测简单、灵活，便于临床上的工作安排。我们的结果发现三种内膜准备方案间的妊娠结局没有统计学差异，与Gelbaya等[11]的研究相一致。对月经规律且有排卵，卵巢储备功能好的患者，采用自然周期方案。对部分月经规律，无优势卵泡发育或无排卵以及卵巢储备功能较差的患者，可采用人工周期[12]。而对于雌、孕激素反应不佳者可采用促排卵方案来准备内膜。因此，应根据个体情况，结合患者经济能力和个人意愿制定个体化方案，以期获得较好的FET妊娠结局。

有研究表明，移植2枚和移植3枚胚胎的妊娠率没有明显差异[13]。本研究结果显示：移植2枚胚胎的妊娠率与移植3枚胚胎相比较，差异无统计学意义；然而，移植3枚胚胎的着床率却显著低于移植2枚胚胎的着床率，可能与移植3枚组患者的年龄、移植次数和胚胎质量等有关，这还需作进一步研究。一般移植胚胎数目越多，其临床妊娠率虽越高，同时多胎妊娠率也增加[14]。目前多胎妊娠已成为ART的严重并发症之一，所以应根据患者的具体情况严格控制移植胚胎数目。本中心现以移植2枚胚胎为主，能最大程度地避免胚胎资源的浪费，进而提高累积妊娠率。

在胚胎冻融过程中，由于冰晶形成、渗透压改变等因素会导致复苏胚胎卵裂球的损伤。损伤的卵裂球对解冻胚胎活力、着床率以及妊娠率均有负面影响[15-16]。它可能破坏细胞信号和破坏胚胎细胞的形态重组，还可能通过释放一些毒性物质损伤胚胎的发育潜能[17-18]。有研究表明，含解冻后损伤的卵裂球，其胚胎的种植潜能下降约30%[19]。我们的研究表明：卵裂球损伤的胚胎临床妊娠率有所降低，着床率也明显降低。评价卵裂球是否损伤可以作为FET选择的重要衡量因素。

综上所述，移植前不同的子宫内膜准备方案对妊娠结局没有显著影响；移植胚胎数对妊娠结局影响不大；年龄和卵裂球的完整性是影响冻融胚胎移植成功的重要因素；冷冻胚胎提前解冻培养后选择进一步卵裂的胚胎进行移植，有助于提高妊娠率和着床率。因此，我们认为一次成功的妊娠不单单是技术的胜利，也是通过考量各种因素诞生健康胎儿的前提。临床上应因人而异，选择合适的子宫内膜准备方案行FET。严格控制冷冻和解冻操作过程的每一环节，减少胚胎损伤，提高胚胎的完整性，以获得较好的妊娠结局。冷冻胚胎提前解冻并培养后，选择进一步卵裂的胚胎进行移植有助于提高FET妊娠率和着床率。

【参考文献】

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[编辑：郭永]

Affecting factors in outcome of frozen-thawed embryo transfer

WANG Wei-zhou#，WEI De-li#，SHEN Yu-liang，WU Di，WANG Ai-ming*

AssistedReproductiveCenter，DepartmentofObstetrics&Gynecology，NavyGeneralHospital，Beijing100048

【Abstract】Objective： To investigate several possible influencing factors on success of frozen-thawed embryos transfer (FET).

Key words：Frozen-thawed embryo transfer；Age;Blastomere growth；Pregnancy rate；Implantation rate

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.06.007

【收稿日期】2015-09-15；【修回日期】2016-01-20

【基金项目】海军总医院创新培育基金(CXPY201408)

【作者简介】王伟周，男，广东人，硕士，主管技师，细胞生物学专业；魏德莉，女，山东潍坊人，硕士，技师，动物胚胎工程专业. (#为共同第一作者；*通讯作者)