利用多重荧光定量PCR协助诊断Crigler⁃Najjar综合征Ⅱ型及Gilbert综合征

刘 凡，车 芳，骆子义

1.深圳市第三人民医院内一科，广东深圳518000；2.广东医学院

利用多重荧光定量PCR协助诊断Crigler⁃Najjar综合征Ⅱ型及Gilbert综合征

刘 凡1，车 芳2，骆子义1

1.深圳市第三人民医院内一科，广东深圳518000；2.广东医学院

目的 尝试建立一个多重荧光定量PCR反应体系对Crigler⁃Najjar综合征Ⅱ型（Crigler⁃Najjar syndromeⅡ，CNSⅡ）及Gil⁃bert综合征（Gilbert syndrome，GS）患者的尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）基因突变进行检测，以运用于协助以上疾病的临床诊断。方法 选取国内外目前报道较多UGT1A1基因常见突变的4个位点［A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp］，利用多重荧光定量PCR Tapman探针法对96例临床诊断为GS或CNSⅡ患者及100名健康体检者全血基因组进行检测，利用T⁃A克隆法对扩增产物进行测序验证。结果 多重荧光定量PCR反应体系可有效检测出实验样本中所存在的以上4种基因突变。A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp在试验组测得的阳性率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。PCR产物电泳及测序结果与其基因检测表型完全一致。结论 利用多重荧光定量PCR技术可以更简便、快捷、有效地对GS或CNSⅡ患者中的UGT1A1基因突变进行检测，为临床诊断提供有用信息。

多重荧光PCR；Crigler⁃Najjar综合征Ⅱ型；Gilbert综合征；UGT1A1

Crigler⁃Najjar综合征（Crigler⁃Najjar syndrome，CNS）及Gilbert综合征（Gilbert syndrome，GS）均属于先天性非溶血性黄疸，是常染色体隐性遗传疾病［1］。其中CNS好发于婴幼儿，分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型（完全型）：患儿出生后迅速出现黄疸，多在出生后1～4 d即有显著黄疸，胆红素浓度可高达289～816 μmol／L，2周内可出现肌肉痉挛和强直、惊厥、角弓反张等胆红素脑病表现；Ⅱ型（部分型）：患儿出生后不久出现黄疸，病情较Ⅰ型相对较轻，无神经系统症状，智力发育亦正常，也有在青少年或成年期发病。GS症状主要表现为反复间歇性未结合型胆红素升高，常见于青少年发病。目前国内外研究［2⁃3］显示，CNSⅠ型和Ⅱ型及GS的本质是负责非结合胆红素代谢的关键酶－尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（uridine diphosphate glucuronosyl⁃transferase，UGT）的相关基因UGT1A1发生突变。目前国内GS及CNS在临床诊断方面仍主要靠临床表现加以推断，尚无较可靠的实验室检查加以论证。本实验尝试建立一个多重荧光定量PCR反应体系对GS及CNS患者的UGT1A1基因突变进行检测，以用于协助以上疾病的临床诊断，并通过DNA测序，对该项技术进行验证。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取深圳市第三人民医院2015年1月－2016年3月临床诊断为GS或CNSⅡ患者作为试验组，年龄8～42岁，平均年龄（28±4）岁；选取已排除病毒性肝炎感染者及中毒性肝炎，且血清总胆红素水平于3.4～17.1 μmol／L的健康体检者作为对照组，入选者年龄14～58岁，平均年龄（37±5）岁。其中试验组96例，对照组100例，向所有入选者说明情况，经其同意后抽取静脉血标本。

1.2 仪器与试剂 ABI7500 FAST实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）、高速离心机（上海化工

机械厂）、琼脂糖凝胶电泳仪（上海艾测电子科技有限公）琼脂糖凝胶回收试剂盒（美国ZYMO RESEARCH生物科技公司）、T⁃载体PCR产物克隆试剂盒、超级感受态制备试剂盒、大肠杆菌DH5α、引物及Tapman探针（上海生工生物有限公司）、AxyPrep质粒基因组DNA小量制备试剂盒（康宁生命科学有限公司）、DNA提取试剂盒（艾德莱公司）、rTaq酶、dNTP、10×buffer、MgCl2等（大连宝生物公司）。

1.3 基因组DNA的抽提 抽取外周静脉血3 ml，用EDTA抗凝，按照艾德莱公司DNA提取试剂盒说明书提取。

1.4 引物与Tapman探针的设计 UGT1A1基因根据NCBI网站上（GenBank NM＿000463.2）基因序列及启动子序列（GenBank AY533181.1），用ABI Primer Express 2软件对A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp这4个常见突变位点进行引物和Taqman探针的设计见表1。

表1 探针和引物序列Tab 1 Probe and primer sequences

1.5 多重荧光PCR反应体系 PCR反应体系（1）：体积30 μl，高压灭菌水17 μl、10×buffer 2.5 μl、25 mmol／L，MgCl23 μl、2.5 mmol／L，dNTP 2 μl、Gly71Arg和Pro229Gln，10 μmol／μl，上、下游引物各0.8 μl，10 μmol／μl野生、突变型探针各0.5 μl、rTaq酶0.3 μl，将PCR液振荡混匀加入96孔板中，加入DNA模板2 μl，PCR条件为：94℃5min；94℃15 s，60℃75 s，40个循环。PCR反应体系（2）：体积30 μl，高压灭菌水17.5 μl、10×buffer 2.5 μl、25 mmol／L，MgCl22.5 μl、2.5 mmol／L，dNTP 2 μl、A（TA）7TAA和Try486Asp 10 μmol／μl，上、下游引物各0.8 μl，10 μmol／μl野生、突变型探针各0.5 μl、rTaq酶0.3 μl，将PCR液振荡混匀加入96孔板中，加入DNA模板2 μl。PCR条件为：94℃5 min；94℃15 s，63℃30 s，70℃45 s，40个循环。每组PCR反应均设立阴性对照和阳性对照。

1.6 琼脂糖凝胶电泳及T⁃A克隆测序 将PCR产物在琼脂糖凝胶上行电泳分离，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行PCR产物回收，用载体连接试剂盒和感受态细胞制备试剂盒连接PCR产物到pUCm⁃T载体及转化到大肠杆菌DH5α上，用蓝白斑筛选法挑取多个克隆菌落行PCR鉴定及摇菌扩大培养，收集菌液，用AxyPrep质粒基因组DNA小量制备试剂盒进行质粒的抽提，送华大基因广州分公司进行测序。

2 结果

2.1 多重荧光PCR检测结果 本多重荧光定量PCR反应体系可有效检测出试验样本中所存在的以下4种基因突变（见图1）：A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp基因型，在试验组及对照组分布情况如表2所示。在以上四个位点中，采用SPSS 19.0软件经χ2检验分析，A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln和Try486Asp四组各自突变总例数（纯合子突变＋杂合子突变）的P值均＜0.05，提示在本试验体系中，实验组测得的阳性率高于对照组，差异有统计学意义。

2.2 T⁃A测序结果 挑取一定数量的样本进行T⁃A克隆并测序，并对检测结果和表型、电泳、测序结果进行比较以达到100%的一致性。

图1 4种突变的多重荧光PCR检测结果 A：A（TA）7TAA；B：Gly71Arg；C：Try486Asp；D：Pro229GlnFig 1 Detection results of multiple fluorescence PCR with 4 kinds of mutations A：A（TA）7TAA；B：Gly71Arg；C：Try486Asp；D：Pro229Gln

表2 4种突变的出现情况Tab 2 The occurrence of 4 kinds of mutations

3 讨论

随着对GS及CNSⅠ、CNSⅡ发病机制的不断研究，发现人体内UGT的活性差异在GS及CNS发病中有重要作用［4］，而UGT基因序列UGT1家族中第一外显子（UGT1A1）的多态性起决定性作用，据Canu等［5］报道，迄今为止，曾被报道过的UGT1A1突变有130种，其中91种（70%）表现为单核苷酸的替换突变（77种错义突变和14种无义突变），21种（16.1%）表现为单核苷酸的缺失，10种（7.7%）表现为单核苷酸的插入，其余8种（6.2%）突变出现在基因的启动子和内含子中。研究［4⁃6］证实：任何一个位点杂合突变，都至少可使UGT1A1表达产物降低到正常人的60%～70%，这一水平尚可维持胆红素在体内正常代谢，但降低到正常的30%以下就会发病。1至2个突变位点累积效应便可使该基因表达下降到正常的20%左右从而表现为黄疸［7］。

其中，GS的UGT1A1基因突变有两种类型：（1）TATA盒TA插入型。Kakadol等［8］发现GS主要与UGT1A1基因启动子上游距启动子25～35个bp处的TATA盒有关，表现为TATA盒中有TA插入，从而使A（TA）6TAA成为A（TA）7TAA。由于有TA的插入，使TATA盒序列延长，导致其与转录因子的结合能力下降，使UGT1合成减少而使UGT活性下降，且每增加一个TA就使UGT活性下降30%［7］；（2）基因突变型。在GS中比较常见的外显子突变位点有：UGT1A1∗6（G71R）、UGT1A1∗7（Y486D）、UGT1A1∗27（P229Q）和UGT1A1∗62（F83L）。在日本、中国和韩国GS患者中，Gly71Arg最为常见，但缺乏群体数据［9］。其他编码区的突变如：第一外显子Pro229Gln、Arg209Trp，第四外显子Pro364Leu、Arg367Gly，第五外显子Try486Asp在亚洲也较常见。

研究［9⁃10］显示：CNS⁃I的UGT1A1突变形式多表现为无义突变（或移码突变）和错义突变，这两种突变都可表现为纯合型或复合杂合型。其核苷酸的插入、缺失和无义突变都可导致提前出现终止密码子、移码突变和剪切位点的改变，从而使UGT的功能缺乏。CNS⁃Ⅱ则主要表现为纯合型错义突变。Canu等［5］提出UGT1A1启动子的基因型和编码区的突变都可决定CNS的表现型（Ⅰ或Ⅱ）。CNS⁃Ⅱ突变多发生在编码区第外1、2、4、5外显子上，以纯合子突变为多见，常与UGT1A1∗28位点一起发生复合型突变，Yamamoto等［10］报道提出不同类型的Gry71Arg与Tyr486Asp的突变及组成不同的组合，在个体中可表现出UGT的活性差异。Gry71Arg的杂合子、纯合子突变、Tyr486Asp的纯合子突变及Gry71Arg＋Tyr486Asp的双纯合子突变，其表现UGT的活性分别为正常人的（60.2± 3.5）%、（32.2±1.6）%、（7.6±0.5）%和（6.2±1.6）%。由此可见，GS及CNSⅠ、CNSⅡ这3种疾病在基因变异方面存在一定程度的共性，其中UGT1A1最终表达产物的水平高低将决定胆红素代谢异常的严重程度。

如今多重荧光PCR技术已广泛用于多种病原微生物同时检测和鉴定，某些遗传疾病及癌基因的分型鉴定，如乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和乳头瘤病毒的分型，13⁃三体综合征及18⁃三体综合征的诊断运用，为目前多种临床疾病的诊断提供更经济、简便及有效的诊断方法。反观目前国内临床上对于GS及CNS的诊断，其中除去CNSⅠ患者由于多在出生后1个月内死于核黄疸，而无后续诊断外，GS及CNSⅡ仍大多依靠排他法。虽然肝穿刺活检术为其诊断的金标准，但这种有创性的检查在临床上很难普遍实行。如今，只有少数大型的医疗机构可用传统的全基因组测序的方法，对GS及CNSⅡ在基因层面上做出诊断。综上所述，目前国内需要相关的基因检测技术，实现对其准确、快捷的诊断，本实验建立的多重荧光定量PCR反应体系可在一定程度上给予疑似患者相关基因检测信息，对其最终临床确诊提供更多帮助。

［1］Bosma P，Chowdhary JR，Jansen PH.Genetic inheritance of Gilbert’s syndrome［J］.Lancet，1995，346（8970）：314⁃315.

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［10］Yamamoto K，Sato H，Fujiyama Y，et al.Contribution of two missense mutations（G71RandY486D）of the bilirubin UDP glycosyl transferase（UGT1A1）gene topheno types of Gilbert’s syndrome and Crigler⁃Najjar syndrome typeII［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，1998，1406（3）：267⁃273.

（责任编辑：马 军）

Using multiple fluorescence PCR technique to assist in the diagnosis of Crigler⁃Najjar syndrome typeⅡand Gilbert syndrome

LIU Fan1，CHE Fang2，LUO Ziyi1
1.Department of Internal Medicine，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518000；2.Guangdong Medical College，China

Objective To establish a multiple fluorescence quantitative PCR reaction system for Crigler⁃Najjar syn⁃drome typeⅡ（CNSⅡ）and Gilbert syndrome（GS）in patients with uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1（UGT1A1）gene mutation testing，and apply to assist in the clinical diagnosis of the disease.Methods We selected 4 common mutation sites［A（TA）7TAA，Gly71Arg，Pro229Gln and Try486Asp］from UGT1A1 gene that currently repor⁃ted at home and abroad at present.Using multiple fluorescence PCR Tapman probe to detect the whole genome that 96 patients were clinical diagnosis of GS or CNSⅡand 100 healthy controls，using the method of T⁃A clone sequencing to test the PCR⁃amplified product.Results This multiple fluorescence quantitative PCR reaction system could effectively detect the test samples of the above 4 kinds of genetic mutations.The positive rate of A（TA）7TAA，Gly71Arg，Pro229Gln and Try486Asp measured in clinical group were higher than the control group，with statistical significance.PCR products electrophoresis and T⁃A clone sequencing were completely conform to the gene types（P＜0.05）.Conclu⁃sion Using multiple fluorescent quantitative PCR technology can be more convenient，fast and effectively to detect UGT1A1 gene mutations in patients of GS or CNSⅡ，provide information for clinical diagnosis.

Multiple fluorescence PCR；Crigler⁃Najjar syndrome typeⅡ；Gilbert syndrome；UGT1A1

R596

A

1006－5709（2016）12－1389－04

2016⁃09⁃01

10.3969／j.issn.1006⁃5709.2016.12.022

深圳市科技计划项目（医疗卫生类）（201607026）

刘凡，硕士，主治医师，研究方向：先天性黄疸的基因检测。E⁃mail：44065895＠qq.com