鲫鱼戴氏西地西菌的分离与鉴定

巴翠玉，赵福广，张培军，焦　雪，冷东泽，李月红（.吉林农业大学，吉林长春308；.吉林省卫生监测检验中心，吉林长春30000）



鲫鱼戴氏西地西菌的分离与鉴定

巴翠玉1，赵福广1，张培军2，焦雪1，冷东泽1，李月红1
（1.吉林农业大学，吉林长春130118；2.吉林省卫生监测检验中心，吉林长春130000）

摘要：本试验旨在从患病鲫鱼的鳃、肾、肝、胰脏等病灶部位分离病原菌，并对其进行鉴定。采用革兰染色的方法观察其为短杆状、呈单双排列的革兰阴性菌，利用美国BD公司生产的PhoenixTM100型全自动微生物分析仪进行生化鉴定及药敏试验分析，结果为戴氏西地西菌，对亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和环丙沙星等高度敏感；对氨曲南和头孢唑啉耐药性最强。并绘制了此菌的生长曲线，发现2～6 h进入对数期，对数期时间较早，22 h后就进入了稳定期。后进行回归试验发现死亡率为66.7%，危害较大。因鱼类中发现戴氏西地西菌较少，所以本文对于鱼类戴氏西地西菌的研究有重要意义。

关键词：鲫鱼；戴氏西地西菌；药敏试验

戴氏西地西菌属西地西菌属，还包括奈氏西地西菌和拉氏西地西菌。戴氏西地西菌为革兰阴性杆菌，大小为0.5～0.6 μm×1～2 μm，大多数菌株能运动，兼性厌氧。是一种条件致病菌，被从人类的尿液、胆汁、痰和血液中检出，但是鱼类中很少发现[1-3]。2011年熊祝嘉等[4]从患者尿液中检测出戴氏西地西菌一例，可导致泌尿系感染，而造成间断躁动6年，加重伴喘憋，呼吸困难等现象。Sevki Kayis等对土耳其-黑海区南方学院的虹鳟鱼细菌进行调查，春天和夏天都各分离出了

1株戴氏西地西菌，其存在部位有肾脏、脾脏和肝、胰脏，这也证实了鱼里面有戴氏西地西菌。本试验从患病鲫鱼中分离到1株戴氏西地西菌，进行药敏试验，筛选了防治药物，为预防和治疗戴氏西地西菌引起的鲫鱼类疾病提供了一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1材料试验鱼，购自吉林省某渔场，鲫鱼出现鳃出血，胸鳍和腹鳍基部及生殖口均出现充血，鱼身出现不同的出血点及溃烂。剖检死鱼，发现鳃部发红且有的鳃丝发白，肠道、肝胰脏、脾脏等处均出现充血症状。

1.2试验仪器及试剂150G全温振荡培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、电热恒温鼓风干燥箱、超净工作台、722N可见分光光度计、革兰染色试剂盒、美国BD公司PhoenixTM100自动细菌鉴定/药敏检测系统、4℃冰箱、微量移液器、试管、直径90 mm平皿、医用1 mL注射器、麦康凯琼脂培养基、LB培养基、生理盐水。

1.3方法

1.3.1病原菌的分离无菌的超净工作台剖检患病鲫鱼，取其鳃、肝、胰脏和肾脏等病灶部位，制成匀浆。将匀浆稀释成不同浓度，微量移液器取200 μL匀浆涂布到麦康凯琼脂平板上，30℃培养24 h后观察菌落生长状态。挑取优势菌群划线纯培养，待菌落形态生长一致，挑取单菌落用80%甘油进行保藏。

1.3.2病原菌的鉴定

1.3.2.1革兰染色法无菌条件下洁净的载玻片滴少许生理盐水，用接菌环将分离纯化后的菌株均匀的涂布到载玻片上，干燥固定，后用结晶紫染液初染、碘液媒染、酒精脱色、番红染液复染后镜检。

1.3.2.2生化鉴定用美国BD公司生产的Phoe⁃nixTM100型全自动微生物分析仪进行鉴定，鉴定板为革兰阴性菌鉴定板，51孔，试验周期15 h结束后观察结果并分析。

1.3.2.3药物敏感试验用美国BD公司生产的PhoenixTM100型全自动微生物分析仪进行鉴定，鉴定板为革兰阴性菌药敏板，85孔，试验周期15 h结束后观察结果并分析。

1.3.2.4生长曲线的测定取-80℃保存的菌株，在超净工作台内取100 μL菌液，加入到液体LB试管中，30℃，150 r/min，培养24 h后同样方法进行传代至第3代[5]。取第三代菌液100 μL，加入盛有100 mL液体LB的锥形瓶中，30℃，150 r/min条件下震荡培养。设此时间为0 h，调分光光度计波长λ=600 nm。分别测定0、2、3、4、5、6、8、10、12h 和16、18、20、24 h各时段所对应的OD值。每个时段测定3个平行试样[6]。

1.3.2.5回归试验试验鱼选用当年的鲫鱼，购自吉林省金龙渔场。驯化7 d，选取体格健壮、规格整齐、游动活跃平均初体重为（98±0.01）g的鲫鱼120尾，随机分为4组，1组对照组，其余3组为试验组。将4组鱼同时放入相同水环境不同鱼缸中(鱼缸规格80 cm×60 cm×100 cm)。对照组每条鱼注射无菌液体LB培养基0.5 mL，试验组每条鱼注射30℃，培养6 h的含致病菌的液体LB 0.5 mL。27℃水温下饲养7 d，观察，并记录[7-8]。从死亡的病灶部位进行病原菌的再分离及鉴定。

2　试验结果

2.1革兰染色结果显微镜下可以观察到红色，短杆状，呈单双排列。结果表明该菌为革兰阴性菌。从鲫鱼鳃部、肝、胰脏和肾脏等部位分离的菌株具有相同特征。

2.2生化鉴定结果该菌与乙酸、Beta-葡二糖和葡萄糖等16项生化指标反应呈阳性，表明该菌能发酵或利用这些物质；而与黏菌素、七叶苷和山梨醇等29项生化指标反应呈阴性。综上所述，该菌鉴定为戴氏西地西菌，鉴定可信度为99%。

2.3药物敏感试验结果结果如表1可知该菌对亚胺培南、美洛培南和环丙沙星等高度敏感；对氨曲南和头孢唑啉耐药性最强。

表1　药敏试验

2.4生长曲线的测定结果根据0、2、3、4、5、6、8、10、12、16、18、20、24 h所测的菌液的OD值结果，取每组的平均值，绘制菌株OD值随时间变化的关系图（如图1）。可看出该菌株2～6 h进入对数期，对数期时间较早，22 h后就进入了稳定期。

图1　菌株OD值随时间变化的关系

2.5回归试验结果攻毒32 h后，鲫鱼精神委顿，很少游动，减食或不食，48 h后出现死亡现象。试验结束后，试验组鱼均出现不同数量的死亡，但对照组没有任何死亡现象，结果如表2。死亡鲫鱼主要症状为胸鳍和腹鳍基部及生殖口均出现充血现象。鱼身出现不同的出血点及溃烂。剖检死鱼，鳃部发红有的鳃丝发白，肠道、肝、胰、脾脏等处均出现充血症状。与之前的病鱼完全吻合。根据上述革兰染色反应及生理生化检验，得到细菌的特征与上述分离的温和气单胞菌的特征完全相符

表2　回归试验

3　讨论

本试验首次从发病鲫鱼分离出戴氏西地西菌，该菌使鲫鱼胸鳍和腹鳍基部及生殖口均出现充血现象。鱼身出现不同的出血点及溃烂。剖检死鱼，鳃部发红有的鳃丝发白，肠道、肝、胰、脾脏等处均出现充血症状。革兰染色结果为红色，是革兰阴性菌，短杆状大小为0.5～0.6 μm×1～2 μm。生化鉴定结果可知该菌与乙酸、Beta-葡二糖、L-色氨酸-AMC和葡萄糖等反应呈阳性，表明该菌能发酵或利用这些物质；而与黏菌素、七叶苷、山梨醇和L-阿拉伯糖反应呈阴性。回归试验结果发现其死亡率达66.7%，对鱼类危害严重。本文对其进行了药敏试验，发现其对亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和环丙沙星等高度敏；感，对氨曲南和头孢唑啉耐药性最强。与朱红楠等[9]2002年在临床检验杂志发表的痰液中检出戴氏西地西菌1例的药敏结果相符合。

本试验致病菌最终鉴定为戴氏西地西菌。本文制作了它的生长曲线，为其后面的研究打下了基础。并利用用美国BD公司生产的PhoenixTM100型全自动微生物分析仪进行药敏分析，结果分离出几种高度敏感的药物，为减少该菌对鲫鱼造成的危害提供实践和理论基础。因鲫鱼感染戴氏西地西菌的发病机理及各方面的理论都不成熟，所以还需要进行进一步的探索。

参考文献：

[1]周薇薇，朱焱，刘云庆.从脑脊液中分离拉氏西地菌1株[J].黑龙江医药科学，2000，04：93.

[2]王甫忠，高燕渝，吕晓菊.奈特尔氏西地西菌肺部感染1例[J].华西医学，2004，03：487-488.

[3]赵成艳，高淑兰.小儿痰中分离出戴维氏西地西菌1例报告[J].大连医学院学报，1993，02：153.

[4]熊祝嘉，李小瑛，王晓岩.尿液中检出戴氏西地西菌1例[J].中国医药导报，2011，30：192.

[5]石琴，贾福苏.细菌传代培养可提高血培养阳性检出率[J].甘肃科技.2006，9（22）：186-187.

[6]胡扬扬，张雅斌，刘艳辉，等.嗜水气单胞菌D102致弱菌株的制备和鉴定[J].吉林农业大学学报，2015，01：43-46.

[7]卢玉婷，郑丹丹，胡扬扬，等.鲤鱼肺炎克雷伯氏菌分离与鉴定[J].中国兽药杂志，2014，09：9-13.

[8]李月红，张培军，郭伟生，崔莹莹，王心.嗜水气单胞菌的分离培养和鉴定[J].吉林畜牧兽医，2007，11：21-22.

[9]朱红楠，赵永法.痰液中检出戴氏西地西菌1例[J].临床检验杂志，2002，03：160.

Isolation and identification of cedecea davisaeof crucian carp

BA Cui-yu1，ZHAO Fu-guang1，ZHANG Pei-jun2，JIAO Xue1，LENG Dong-ze1，LI Yue-hong1
（1.Jilin Agricultural University，Jilin 130118，China；2.Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Jilin 130000，China）

Abstract：The purpose of this experiment was to isolate and identify pathogenic bacteria from the gill，kidney and liver of the diseased crucian carp.Using Gram staining method，we observed the short rod and single and double arrangement of gram negative bacteria.And then we used American BD company production of PhoenixTM 100 type automatic microorganism analyzer to do biochemical identification and susceptibility test analysis.The results showed that it was cedecea davisae，which was highly sensitive to the imipenem，meropenem south，levofloxacin and ciprofloxacin，and resistant to aztreonam and cefazolin.And the growth curve of this strain was plotted，and it was found that after 2～6 h it entered the logarithmic phase，and the logarithmic phase was earlier，and then entered the stable period after 22 h.After the regression test, the mortality rate was found to be 50%.Since cedecea davisae is rarely found in fish，our findings have great significance.

Key words：crucian carp；cedecea davisae；drug sensitivity test Corresponding author：LI Yue-hong

中图分类号：S965.117

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0107-03

收稿日期：2015-08-12

基金项目：国家自然科学基金（30972191）；农业部948项目农业（2014Z34），长春市农业先进实用技术的示范推广项目（2013193）

作者简介：巴翠玉（1992-），女，硕士生，研究方向为分子病原微生物学与分子免疫学，E-mail：bacuiyu@163.com

通讯作者：李月红，E-mail：liyhong@sina.com