维氏气单胞菌灭活疫苗的制备及对锦鲤免疫效果评价

陈亨利，莫金龙，康元环，陈　龙，毕建飞，张冬星，李芳芳，李　影，单晓枫（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）



维氏气单胞菌灭活疫苗的制备及对锦鲤免疫效果评价

陈亨利，莫金龙，康元环，陈龙，毕建飞，张冬星，李芳芳，李影，单晓枫
（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118）

摘要：为证明维氏气单胞菌灭活疫苗对锦鲤机体的免疫效果，应用福尔马林灭活法制备了维氏气单胞菌灭活疫苗对免疫后的锦鲤进行酸性磷酸酶活力检测、超氧化物歧化酶活力检测、吞噬活力等各项免疫指标的检测，并于试验第5周进行免疫保护力试验。结果显示，酸性磷酸酶活力在试验开始后有所上升，在第2周达到最高；超氧化物歧化酶活力上升，并在第2周达到最高；经观察，第3周开始白细胞的数量增多，吞噬活性同时增大；抗体效价于第3周达到最大值，并持续一段时间；免疫4周后攻菌检测免疫保护力，测得试验组的相对免疫保护率RPS为86.4%。上述结果表明，维氏气单胞菌灭活疫苗能够诱导锦鲤机体产生免疫应答反应，并能形成一定保护力。

关键词：维氏气单胞菌；灭活疫苗；锦鲤；免疫效果

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii），属气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），为一种新型人鱼共患病原菌，能够生存于淡水、海水及污泥中，可引起包括鲤（Cyprinuscarpio）[1]、鲫鱼（Carassiusauratus）[2]、黄颡鱼（Pelteobagrusful⁃vidraco）[3]、乌鳢（Ophicephalus argus）[4]等多种经济鱼和观赏鱼的疾病，通常表现为病死鱼出现腹水及消化道出血，也可引起人类的腹泻甚至败血症[5-7]。

灭活疫苗因其安全性好，制备方法简便、快捷，储存、运输要求低，受母源抗体的影响小等诸多优点而得到广泛应用[8]。维氏气单胞菌灭活疫苗在国内研究报道甚少，李正伟[9]研究的维氏气单胞菌灭活疫苗对草鱼及鲫鱼有较好的免疫保护性。本试验通过甲醛灭活维氏气单胞菌，制备维氏气单胞菌灭活疫苗，并通过酸性磷酸酶活力检测、超氧化物歧化酶活力检测、吞噬活力等指标综合评价维氏气单胞菌菌株灭活疫苗的免疫效果。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株及试验动物维氏气单胞生物菌JLL-1菌株，由本实验室分离鉴定；金黄色葡萄球菌，由本实验室保存；健康锦鲤，体长约为15 cm，体重约为80～90 g，购自长春市某养殖场，饲养于消毒水族箱中，水体保持28℃恒温，过滤，供氧，并每隔3 d更换水族箱体积2/3的水以保证水质良好。

1.1.2主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（购自英国Oxoid公司）；甲醛（购自北京化工厂）；RS琼脂（购自北京陆桥生物技术责任有限公司）；酸性磷酸酶检测试剂盒及超氧化物歧化酶检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）；肝素钠及瑞氏吉姆萨染色液（购自北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.3灭活疫苗的制备条件优化制备1×108CFU/mL的菌液并分装于试管中，按照甲醛浓度分别为0.05%，0.10%，0.20%，0.30%的剂量加入到各管中，每种浓度两管，并将不同浓度的甲醛菌液置于30℃恒温培养箱及4℃低温冰箱中，分别于第6、7、8、9、10、11、12小时每管取100 μL涂布于RS琼脂上30℃倒置培养至24 h。观察并记录细菌生长情况，以此判定JLL-1菌株的最佳灭活条件。

1.1.4鱼体免疫试验将200尾锦鲤随机分成2组，每组100尾，置于2个灭菌的28℃恒温水族箱中。在对鱼类进行免疫前，将灭活疫苗用pH值7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。试验组腹腔注射浓度为1×108CFU/mL的灭活疫苗，每尾0.2 mL。对照组腹腔注射pH值7.2的PBS，每尾0.2 mL。

在免疫前0周至免疫后第4周，每周从试验组和对照组中分别随机选取10尾锦鲤，并用适量丁香油将其麻醉[10-11]，进行尾静脉采血，采血后的鱼淘汰处理。制得鱼血清于-20℃冰箱中冻存，备用。

1.1.5酸性磷酸酶活力（ACK）检测反应于96孔细胞培养板中进行，具体操作见南京建成生物工程研究所生产的酸性磷酸酶活力检测试剂盒，并按说明书中公式计算各组酶活力。

1.1.6超氧化物歧化酶（SOD）活力检测反应于96孔细胞培养板中进行，具体操作见南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶活力检测试剂盒，并按说明书中公式计算各组SOD活力。

1.1.7白细胞吞噬活性检测参照范秀荣[12]等人的方法，随机观察100个白细胞，计算白细胞吞噬百分比（PP）及白细胞吞噬指数（PI）。

1.1.8抗体效价测定采用传统的试管凝集法检测血清抗体水平，倍比稀释法将0.1 mL待检血清样本用0.9%生理盐水稀释至第10管，每管0.5 mL，并在1-10管中分别加入用0.85%生理盐水洗涤稀释的JLL-1菌液（1×108CFU/mL）0.5 mL。将试管置于30℃恒温培养箱，12 h，取出，室温放置3 h，观察细菌凝集程度。

1.1.9免疫保护率测定免疫4周后，对试验组及对照组剩余的各50尾锦鲤进行腹腔注射攻菌，攻菌菌液为0.85%生理盐水稀释的JLL-1菌液，浓度为2×107CFU/mL，每尾0.2 mL，连续观察14 d，期间正常饲喂，换水。记录各组锦鲤死亡数，计算出相对免疫保护率（RPS）。

2　结果

2.1灭活疫苗条件通过测得菌液在不同条件的生长情况，最后得出结论：甲醛浓度为0.05%，在4℃下，灭活12 h。经安全试验灭活疫苗被完全灭活。

2.2酸性磷酸酶（ACP）活力检测结果波长520 nm酶标仪测定各孔数值后，根据公式，计算各组酸性磷酸酶ACP数值，并经SPSS分析，得出试验组及对照组酸性磷酸酶（ACP）变化趋势及差异。试验组ACP活力由免疫前的29.26金氏单位/mL开始上升，在免疫第1周达到88.73金氏单位/mL，在第2周到达最大值104.6金氏单位/mL，在第3周下降到61.9金氏单位/mL，在第4周下降到36.23金氏单位/ml，对照组各时间点的ACP活力保持在27.41金氏单位/mL～35.72金氏单位/ml范围内，变化不显著。

2.3超氧化物歧化酶（SOD）活力检测结果波长450 nm酶标仪测定各孔数值后，根据公式，计算各组超氧化物歧化酶SOD数值，并经SPSS分析，得出试验组及对照组超氧化物歧化酶变化趋势及差异。试验组SOD活力由免疫前的132.84 U/mL开始上升，在免疫第1周达到205.96 U/mL，在第2周到达最大值224 U/mL，在第3周下降到179.72 U/ mL，在第4周下降到173.03 U/mL，对照组各时间点的SOD活力保持在129.57 U/mL～149.03 U/mL范围内，变化不显著。

2.4白细胞吞噬活性

2.4.1白细胞吞噬百分比（PP）显微镜镜检，并随机观察100个白细胞的吞噬情况，并求3组平行试验的平均值，白细胞吞噬显微照片，（见中插彩版图3）。试验组的吞噬百分比（PP）在0周时为13%与对照组14.67%无差异，试验组免疫后第1周上升为17%，第2周继续上升到22.33%，在第3周时达到最大值36.67%，而第4周在第3周基础上下降至25%。而对照组变化不明显。

2.4.2白细胞吞噬指数（PI）显微镜镜检并随机观察100个白细胞的吞噬情况，根据公式计算其PI值，并求3组平行试验的平均值，试验组的吞噬指数（PI）在0周时为1.47，与对照组1.37无差异，试验组免疫后第1周上升到1.50，第2周继续上升到2.07，在第3周时达到最大值2.91，而第4周在第3周基础上略下降至2.25。而对照组变化不明显。

2.5抗体效价检测结果根据方法1.2.8，采用传统的试管凝集法，测得试验组的抗体效价呈上升趋势，免疫前0周抗体效价为1∶40，在第1周上升到1∶160，在第2周呈2倍上升，抗体效价为1∶320，而在第3周达到最大值1∶1 280，第4周下降到1∶640，但仍高于对照组，而对照组各时间点的抗体效价均为1∶40。

2.6免疫保护率检测结果免疫4周后，进行攻菌试验，重复3次。在连续观察14 d后，试验组平均死亡率为12.33%，对照组平均死亡率为82.33%，差异极显著（P<0.0001）。根据公式计算出试验组的相对免疫保护率RPS为85.02%。

图1　ACP活力变化趋势

图2　SOD活力变化趋势

图4　白细胞吞噬指数（PI）变化趋势

图5　抗体效价变化趋势

图6　免疫保护率检测

3　讨论

维氏气单胞菌作为近年来新发现的一种人鱼共患病病原菌，广泛存在于水体环境中，对水产养殖行业来说是一种新的威胁。国内对维氏气单胞菌的研究相对较少，因而不易确诊。鱼用疫苗发展较畜牧业晚，在生产中应用的最多的是灭活疫苗。研究应用本实验室保存的维氏气单胞菌JLL-1株作为试验材料，采用福尔马林灭活法进行灭活疫苗制备，最终确定0.05%甲醛浓度，4℃作用12 h为最佳灭活条件，能够彻底杀灭细菌的同时，最大程度保留病原菌的免疫原性。

试验中，经检测，在免疫后的3周内，试验组与对照组的ACP活力相比，差异均极显著（P<0.0001），第4周试验组ACP活力下降，但仍与对照组呈显著性差异（P<0.01或P<0.05）。免疫组ACP活力呈现先上升再下降的趋势，并在第2周时达到最大值，这可能是由于机体需要一定的时间来产生酸性磷酸酶。2周后大部分抗原被机体清除后，ACP活力逐渐下降但仍高于对照组。ACP可能在动物的细胞增殖分化、免疫调节等过程起重要作用[13]，可见，对锦鲤腹腔注射灭活的JLL-1菌液，能够显著增强机体ACP的活力，进而起到提高免疫效果的作用。

锦鲤在注射维氏气单胞菌灭活疫苗后，SOD活力从第1周开始相对于对照组呈上升趋势，在第2周达到最大值，免疫后各周SOD活力均与对照组呈极显著性差异（P<0.0001）。SOD是体内一种重要的可清除自由基的物质，SOD活力的提高证明该灭活疫苗能够有效加强机体对外来物质的清除作用。

在对锦鲤免疫后，白细胞的吞噬指数（PI）和吞噬百分比（PP）在免疫的第2周开始，直到免疫的第4周内，均和对照组呈极显著差异（P<0.0001）。而在免疫第1周，吞噬百分比（PP）与对照组差异不显著（P>0.05），吞噬指数（PI）与对照组呈显著差异（P<0.01或P<0.05）。PP及PI的变化呈一定的正相关性，说明白细胞数量增多的同时，吞噬病原菌的能力也在增强。由于白细胞分化需要一定的时间，因此，在免疫的第1周，对照组和试验组吞噬白细胞的数量增加的并不显著，而试验组中灭活疫苗刺激了原有白细胞的活性，使试验组白细胞吞噬细菌的数量有所增加。

试验过程中，免疫组锦鲤的抗体效价呈先上升后下降的趋势，并在第3周达到最大值1∶1 280，并且免疫后第2周至第4周内，试验组抗体效价均与对照组呈极显著差异（P<0.0001）。由于鱼类抗体的形成期比哺乳动物要长，因此锦鲤血清抗体效价在第3周时才达到最高峰，并在第4周时仍维持在较高的水平。

本试验只测定了一免后各项指标的变化，二次免疫对锦鲤免疫性能的影响有待进一步的研究。免疫4周后，试验组的相对免疫保护率为85.03%，且各组试验均证明，维氏气单胞菌JLL-1株灭活疫苗能够使锦鲤产生较强的免疫力，在一定程度上能够促进锦鲤抵抗维氏气单胞菌的感染。

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Preparation of Aeromonasveronii inactivated vaccineand evaluateof immuneeffect on koi

CHEN Heng-li，MO Jin-long，KANG Yuan-huan，CHEN Long，BI Jian-fei，ZHANG Dong-xing，LI Fang-fang，LI Ying，SHAN Xiao-feng
（College of animal science and technology，jilin agricultural university，Changchun 130118，China）

Abstract：To prove the immune effect of the inactivated vaccine against Aeromonas veronii on koi，we made the formalinkilled Aeromonas veronii vaccine，which were used for the test of acid phosphatase activity，superoxide dismutase activity detection and phagocytic activity on vaccinated koi .The immune protection experiment was conducted on the 5thweek .The results showed that the activity of acid phosphatase increased and reached the peak point on 2ndweek . The activity of superoxide dismutase in⁃creased and reached the peak point on the 2ndweek.We observed that the number of leukocytes increased on the 3rdweek，mean⁃while，the activity of phagocytic increased.The antibody titer reached the maximum on the 3rdweek and lasted for a long time.On the 4thweek post-immunization，the fish were challenged with Aeromonas veronii to detect the protective effects of the vaccine，and it was found that the immune protective rate was 86.4% in the experimental group.In conclusion，Aeromonas veronii inactivated vac⁃cine can prevent the koi from Aeromonas veronii，and formed the immune protection.

Key words：Aeromonas veronii；inactivated vaccine；koi；immune effect Corresponding authors：SHAN Xiao-feng；LI Ying

中图分类号：S852.61

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0110-04

收稿日期：2015-03-31

基金项目：国家自然科学基金项目（31201927）；吉林省重点科技攻关项目（20150204065NY）

作者简介：陈亨利（1991-），男，硕士，从事动物微生物学研究，E-mail：ch19108@163.com

通讯作者：单晓枫，E-mail：sxf1997@163.com；李影，E-mail：thliying@163.com