甜味剂莱鲍迪苷A的致突变作用试验

郝褔星，郑玲敏，周泽伟，陈秀云，张雨梅，3（.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州225300；3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）



甜味剂莱鲍迪苷A的致突变作用试验

郝褔星1，2，郑玲敏1，周泽伟1，陈秀云1，张雨梅1，3
（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州225300；3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）

摘要：为了评价甜菊糖苷中的主要成分之一莱鲍迪苷A的致突变作用，在2 500～4 μg /皿范围内，对莱鲍迪苷A（含量≥97%）进行了Ames试验，灭菌水作为阴性对照；以5.0 g/kg体重、2.5 g/kg体重和1.25 g/kg体重剂量进行了小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验，以40 mg/kg环磷酰胺为阳性对照，生理盐水为阴性对照。结果Ames试验中，莱鲍迪苷A对TA97、TA98、TA100和TA102菌株的回变菌落数均小于阴性对照组的两倍，且未见剂量-反应关系，Ames试验阴性；小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验均为阴性。表明莱鲍迪苷A在试验剂量下无致突变作用。

关键词：莱鲍迪苷A；Ames试验；微核试验；精子畸形试验

甜菊糖是从原产南美巴拉圭东北部的菊科小灌木甜叶菊（stevia rebaudiana bertoni）的叶子中提取出的一类天然的低热量的高倍甜味剂，其甜度是蔗糖的250～300倍，热量仅为蔗糖的1/250左右[1-2]。目前为止，已从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖苷[3-4]分别为：甜菊糖苷（stevioside）、甜菊醇双糖苷（steriolbioside）、莱鲍迪苷A（rebaudioside A）、莱鲍迪苷B（rebaudioside B）、莱鲍迪苷C（rebaudioside C）、莱鲍迪苷D（rebaudioside D）、莱鲍迪苷E（rebaudiosideE）、杜尔可苷A（dulcoside A）。其中甜菊糖苷是主要成分，占60%～70%，甜度为蔗糖的300倍；其次是莱鲍迪苷A，占15%～20%，甜度为蔗糖的450倍，甜味较纯正，且甜味最接近蔗糖，其他组分含量都较少。甜菊糖苷类高甜度低热量的特点，作为蔗糖的替代品在食品中应用越来越多，在饲料中作为甜味剂也有应用。

由于甜菊糖苷类的规格资料不足，代谢物甜菊醇体外实验中表现出致突变性[5-6]，对其应用安全性存在着争议[7]。至2008年，在联合国粮农组织（FAO）、世界卫生组织食品添加剂专家委员会（JECFA）第69届会议上，确定了甜菊糖苷每日允许摄入量（ADIS）为0～4 mg/kg体重（以甜菊醇表示）[8]。同年，美国药品食品管理局（FDA）批准允许在食品中使用甜叶菊提取物莱鲍迪苷A。2012年，法国成为欧盟第一个批准在食品和饮料产品内使用高纯度莱鲍迪苷A（97%）的国家[9]。但目前国内对莱鲍迪苷A的深入研究和其在食品中的应用还相对较少。本文通过鼠伤寒沙门菌回复突变试验（Ames试验）、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验，研究莱鲍迪苷A在体内体外的致突变作用，为莱鲍迪苷A作为天然甜味剂在食品或饲料中的应用的安全性评价积累资料。

1　材料与方法

1.1受试物及试剂莱鲍迪苷A，含量≥97%，批号2012-002P，由某生物技术公司生产。

2-氨基芴（2-AF），纯度＞99%，日本东京化成工业株式会社；敌克松，纯度98.8%，美国DIMA技术有限公司；4-硝基喹啉-N-氧化物、甲基磺酸甲酯，纯度均大于98%，美国Amresco公司；多氯联苯（Aroclor1254），美国Crescent Chemical有限公司。

莱鲍迪甙A试液配制：称取适量溶于水，临用前用无菌蒸馏水配制并梯度稀释至所需浓度，现配现用。阳性对照物均用二甲基亚砜（DMSO）配制。

1.2实验菌株TA97、TA98、TA100和TA102菌株，由江苏省疾病控制中心提供，-80℃保存。试验菌株生物学特性按GB 15193.4-2003标准方法鉴定符合试验要求。

1.3实验动物ICR小鼠，体重24～28 g；Wistar大鼠，体重180～200 g，由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号：SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号：SYXK（苏）2012-0029。饲喂经60Co照射饲料，24±2℃，湿度60±20%，自由采食和饮水，饮水为符合城市饮用水标准的自来水。试验前在实验环境中适应3 d，灌胃前停食12 h，不限制饮水。

1.4Ames试验

1.4.1大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备选择健康雄性成年Wistar大鼠2只，采用多氯联苯（Aroclor1254）（200 mg/mL玉米油溶液，按500 mg/ kg体重）腹腔注射作为诱导剂。按GB 15193.4-2003方法制备S9，生物活性鉴定合格后，-80℃保存备用。

1.4.2平板掺入法Ames试验以鼠伤寒沙门菌突变株TA97、TA98、TA100和TA102菌株为试验菌。采用平板掺入法进行试验。根据预试验结果，受试物莱鲍迪苷A的剂量设置分别为：2500 μg /皿、500 μg /皿、100 μg /皿、20 μg /皿、4 μg /皿；另设阴性（溶剂）对照组和阳性对照组，每个处理组分加S9（+S9）和不加S9（-S9）两个系列，每个系列设3个平行平皿。阳性对照：加S9时四菌株均用2-氨基芴（2-AF），浓度为100 μg/mL（10 μg/100 μL·皿）；不加S9时TA97、TA98用敌克松，浓度为0.5 mg/mL（50 μg/100 μL·皿），TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，浓度为5 μg/mL（0.5 μg/ 100 μL·皿），TA102用甲基磺酸甲酯，浓度为10 μg /mL（1.0 μg/100 μL·皿）。

双盲法记录每皿回变菌落数。按GB 15193.4-2003法规定的标准判定Ames试验结果为阴性或阳性。

1.5小鼠骨髓细胞微核试验莱鲍迪苷A配制成各试验浓度的水溶液。采用灌胃染毒，灌胃体积为0.2 mL/10 g。

瑞鲍迪苷A分为5.0 g/kg体重、2.5 g/kg体重和1.25 g/kg体重3个剂量组；另以40 mg/kg体重环磷酰胺腹腔注射为阳性对照和蒸馏水为阴性对照。每组10只小鼠，雌雄各半。各组染毒二次，时间间隔24 h。于第二次给予受试物后6 h处死小鼠，骨髓制片。按农业部1147号公告“兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则”进行微核率的检查并判定微核试验的结果。

1.6小鼠精子畸形试验莱鲍迪苷A精子畸形试验剂量组同微核试验。每组10只雄性ICR小鼠，每天染毒1次，连续5 d。于第1次给予受试物后35天脱颈椎处死小鼠，按农业部1147号公告“兽药小鼠精子畸形试验指导原则”进行精子畸形检查。每只小鼠检查1 000个精子，计数畸形精子数并进行分类。

1.7统计分析数据统计采用SPSS12.0，显著性比较采用χ2分析。

表1　莱鲍迪苷A鼠伤寒沙门菌回复突变试验　（±SD）

表1　莱鲍迪苷A鼠伤寒沙门菌回复突变试验　（±SD）

TA97TA98TA100TA102组别　-S9　+S9　-S9　+S9　-S9　+S9　-S9　+S9 2500 μg /皿　125.36±6.74　128.00±4.28　40.02±4.36　42.25±5.32　160.36±6.52　170.00±8.28　248.22±11.32　252.98±21.02 500 μg /皿　125.05±6.13　127.67±6.42　40.00±4.27　43.33±1.05　162.22±10.00　172.55±11.32　249.25±6.36　248.58±22.31 100 μg /皿　126.00±5.28　128.00±6.24　39.84±6.12　41.19±1.25　168.37±3.65　180.58±12.55　247.89±13.62　249.98±21.08 20 μg /皿　124.31±3.98　127.32±6.23　39.84±4.41　38.88±8.29　161.18±12.08　181.66±5.55　253.36±10.02　250.39±10.00 4.0 μg /皿　125.30±3.08　122.89±3.58　38.17±5.00　38.59±5.68　161.22±3.55　169.66±6.99　250.36±7.49　250.28±14.58灭菌水　124.50±5.20　130.00±3.51　40.00±7.19　43.32±3.28　160.55±7.18　177.22±14.01　248.88±12.25　248.39±11.03 DMSO　131.00±3.28　128.43±5.05　38.18±3.56　41.38±4.15　165.49±5.00　178.21±8.00　250.91±7.29　254.69±22.05 ＞850　＞800　＞200　＞400　＞480　＞400　＞850　＞550阳性对照　敌克松　2-AF　敌克松　2-AF　4-硝基喹啉-　2-AF　甲基磺酸甲酯　2-AF （50 μg）　（10 μg）　（50 μg）　（10 μg）　N-氧化物（0.5 μg）（10 μg）　（1.0 μg）　（10 μg）

表2　莱鲍迪苷A小鼠骨髓细胞微核试验及精子畸形试验结果　（±SD）

表2　莱鲍迪苷A小鼠骨髓细胞微核试验及精子畸形试验结果　（±SD）

注：与阴性对照比较，*：P<0.05；**：P<0.01

各类畸形精子率/ %剂量组　动物数　微核率（‰）　检查精子数　精子畸形率/ %　无钩　香蕉形　无定形　胖头　尾折叠　双头　双尾阴性对照　10　3.82±1.07　1000×10　2.55±0.09　35.29　15.29　34.90　10.20　3.92　0.00　0.39 1.25g/kg b.w.　10　3.79±0.60*　1000×10　2.53±0.16*　35.57　15.41　32.41　10.67　4.74　0.39　0.79 2.5 g/kg b.w.　10　3.64±0.66*　1000×10　2.80±0.10*　35.36　15.00　32.14　10.71　5.36　0.36　1.07 5.0 g/kg b.w.　10　4.55±1.34*　1000×10　3.15±0.20*　35.56　15.24　30.16　11.11　6.03　0.63　1.27阳性对照　10　21.32±4.15**　1000×10　11.01±0.24**　37.60　13.71　30.43　10.08　4.72　1.91　1.54

2　结果

2.1Ames试验实验中4种试验用鼠伤寒沙门菌株菌苔生长正常，阳性对照试验各菌株反应合格。莱鲍迪苷A每皿剂量在2 500 μg～4.0 μg范围内，有或无S9时，平均回变菌落数均小于阴性（溶剂）对照组的两倍，未见剂量-反应关系（见表1），且两次重复试验结果一致。表明莱鲍迪苷A的Ames试验结果为阴性。

2.2小鼠骨髓细胞微核试验莱鲍迪苷A小鼠骨髓细胞微核试验微核率见表2。各试验组PCE/ NCE比值在正常范围内。阳性对照组的微核率与阴性对照组比较差异极显著（P<0.01）。莱鲍迪苷A高、中、低剂量组与阴性对照组相比，均无显著性差异（P>0.05），且各试验组微核率之间无剂量-反应关系。可判定莱鲍迪苷A的小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。

2.3小鼠精子畸形试验莱鲍迪苷A小鼠精子畸形试验结果见表2。阳性对照组精子畸形率显著高于阴性对照组（P<0.01)。受试物3个剂量组的精子畸形率与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。精子畸形类别以无钩、无定形较多，香蕉形、胖头次之，尾折叠较少，双头和双尾的则更少。莱鲍迪苷A小鼠精子畸形试验结果为阴性，表明对小鼠的生殖细胞无致突变性。

3　结论与讨论

在试验条件下，莱鲍迪苷A的鼠伤寒沙门菌突变试验结果为阴性；对小鼠骨髓细胞微核试验及对小鼠精子畸形试验均为阴性，说明该受试物在试验剂量范围内无致突变作用。

虽然历史上对甜菊糖的安全性存在过争议，但随着对甜菊糖的毒理研究深入，加上JECFA已制定了甜菊糖的的每日允许摄入量为4mg/kg，FDA及法国等允许莱鲍迪苷A用于食品，说明莱鲍迪苷A在低于ADI的浓度下食用是安全的。

莱鲍迪苷A在甜菊糖苷中含量较高，一般占混合糖苷的30 %～70 %，经过纯化处理去除了带异味的其他糖苷的影响，使其甜度高、味质好，可作为甜菊糖的精加工高端产品，是较理想的天然甜味剂，可较完全地替代蔗糖，甜度成本也比蔗糖低，使用中配比方便，因此在食品工业中将得到越来越广泛的应用。此外，这种低热量的甜味剂更适合肥胖症和糖尿病患者等对甜品的需求，

符合现代食品的发展方向。莱鲍迪苷等甜菊糖苷作为饲料添加剂在乳猪料等中添加，也具有较低的甜度成本，作为饲料添加剂应用具有潜在的广阔市场。

参考文献：

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中图分类号：TS201.7

文献标志码：B

文章编号：0529-6005（2015）05-0104-03

收稿日期：2014-04-03

基金项目：江苏高校优势学科建设工程项目资助；扬州大学“新世纪人才工程”资助

作者简介：郝褔星（1982-），男，讲师，硕士，从事兽医临床教学及农技推广工作，E-mail：330848219@ qq.com

通讯作者：张雨梅，E-mail：zym@yzu.edu.cn