橙皮素对大鼠肾动脉血管环的舒张作用机制探讨

牛玉忠，韩玲军

橙皮素对大鼠肾动脉血管环的舒张作用机制探讨

牛玉忠1，韩玲军2

1.国药控股山西有限公司(太原 030001)；2.太原师范学院

摘要：目的研究橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞的舒张作用，并探讨其机制。方法大鼠处死后，在解剖显微镜下分离其肾动脉血管三级分支，剪成2 mm长的血管环，通过微血管张力记录仪记录其张力，利用全细胞膜片钳技术记录其电压依赖性钾电流。首先观察橙皮素对静息状态下肾动脉张力的影响。然后将肾动脉血管环用60 mMKCl或10-5mol/L PE预收缩达坪台，加入橙皮素(10-6～10-4mol/L)对肾动脉进行浓度依赖性舒张，以预收缩的最大张力为100%，测定橙皮素对预收缩肾动脉血管环的舒张百分比。用60 mMKCl或10-5mol/L PE预收缩肾动脉达坪台后，预孵Kv通道抑制剂4-AP或KCa通道抑制剂TEA10 min，然后加入不同浓度梯度的橙皮素(10-6～10-4mol/L)舒张肾动脉，观察4-AP或TEA对橙皮素舒张肾动脉的影响。采用两步酶解法分离得到大鼠肾动脉血管平滑肌细胞，采用全细胞膜片钳技术，观察并记录橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾电流的影响。结果橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞的静息张力没有产生显著影响。 橙皮素(10-6～10-4mol/L)可使预收缩的肾动脉血管环发生浓度依赖性的舒张，最大舒张幅度分别为(53.39±5.27) %(KCl预收缩)和( 60.13±4.17 )%(PE预收缩)。预孵TEA没有对橙皮素的舒张作用产生显著影响，预孵4-AP使橙皮素的舒张幅度减小了14.26%(KCl预收缩)和18.31%(PE预收缩)。橙皮素(浓度选用舒张实验计算所得RC50)可使大鼠肾动脉血管平滑肌细胞的电压依赖性钾电流I-V曲线发生非平行上移，最大电流密度增加了45.24%。结论橙皮素对KCl或10-5mol/L PE预收缩的大鼠肾动脉血管环有浓度依赖性的舒张作用； 橙皮素对大鼠肾动脉的舒张作用与激活电压依赖性钾通道有关，与钙激活钾通道无关。

关键词：肾动脉；舒张血管；橙皮素；钙激活钾通道；电压依赖性钾通道

橙皮素是一种黄酮类化合物，多存在于枳壳、陈皮、青皮等中药材中。橙皮素具有多种生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、降脂、抗血小板聚集、舒张血管等[1-4]，这些作用表明橙皮素能够对心血管系统的疾病起到一定的预防与治疗作用。但橙皮素能否通过舒张肾动脉而降低肾动脉压力却未见报道。本课题观察橙皮素对离体大鼠肾动脉的舒张作用，并探讨其机制，为橙皮素预防和治疗肾动脉高压提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物SD大鼠，雄性，体重230 g～250 g，购于山西医科大学实验动物中心，将动物饲养1周后开始实验。

1.1.2药品橙皮素，PE，4-AP，TEA，木瓜蛋白酶，二硫丁四醇香，白蛋白，胶原蛋白F/H购自Sigma公司(美国)。其他试剂为国产分析纯。

1.1.3主要实验仪器DMT张力换能器，澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司产品。Powerlab 生物信号采集分析系统，澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司产品。

1.2方法

1.2.1离体大鼠肾动脉血管环的制备大鼠麻醉后，放血处理，取其肾脏，置于4 ℃100% 氧饱和的PSS液中(KCl 5.8，NaCl 144，MgCl24.2，CaCl22.5，HEPES 5，Glucose 11.1)。在解剖显微镜下找到并分离出大鼠肾动脉的三级分支，剪成2 mm长的血管环，利用两根直径40 μm的钢丝悬挂于血管张力记录仪。血管环制备、张力记录及血管反应性检测的具体方法均参照文献[5]。

首先用60 mmol/L连续刺激血管3次，选取每次收缩幅度相差不超过10%且收缩张力大于2 mN的血管环用于正式实验。在静息状态下，向浴槽内加入浓度梯度的橙皮素或等渗透压的生理盐水作为空白对照，观察肾动脉血管环肌张力的变化。用60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩肾动脉血管环达坪台，然后向浴槽内累计加入浓度梯度的橙皮素或等渗透压的生理盐水作为空白对照，当前一浓度舒张达坪台时再加入下一浓度，观察肾动脉血管环肌张力的变化。以60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE收缩肾动脉所达到的最大张力为100%，计算每一个浓度橙皮素或生理盐水所致肾动脉张力的百分比。

用60 mM KCl或10-5mol/L PE预收缩肾动脉血

管环达坪台，向浴槽内加入电压依赖性钾通道阻断剂4-AP或大电导钙激活钾通道阻断剂TEA，孵浴10 min后，累积加入浓度梯度的橙皮素或等渗透压的生理盐水，以60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE收缩肾动脉所达到的最大张力为100%，计算每一个浓度橙皮素或生理盐水所致肾动脉张力的百分比。

1.2.2橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾电流的影响参照文献[6]，用两步酶解法分离得到大鼠肾动脉血管平滑肌细胞：第一步酶解液为含有 0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，0.5 mg/mL二硫丁四醇，0.5 mg/mL 白蛋白的无钙PSS液；第二步酶解液为：含0.5 mg/mL胶原蛋白F，0.5 mg/mL 胶原蛋白H和5 mg/mL白蛋白的无钙 PSS 液。

1.2.3肾动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钙电流记录钳制电压为-60 mV，以10 mV为步阶，从-60 mV开始，逐渐刺激到+60 mV，刺激时长为500 ms。首先记录空白情况下的大鼠肾动脉Kv电流，然后记录加入橙皮素后的Kv电流，橙皮素所用浓度为前面舒张实验时计算所得的RC50值。

2结果

2.1橙皮素对大鼠肾动脉血管环静息肌张力的影响在静息状态下，向浴槽内加入不同浓度的橙皮素和空白对照的生理盐溶液，均没有对大鼠肾动脉血管环的静息肌张力产生显著影响。

2.2橙皮素对60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩肾动脉血管环的舒张作用60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩肾动脉血管环的最大收缩幅度分别为(3.45±1.28)mN和(4.02±1.36 )mN。

橙皮素可浓度依赖性的舒张60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩的肾动脉血管环，最大舒张幅度分别为(53.39±5.27)%和(60.13±4.17)%。

提前预孵大电导钙激活钾通道阻断剂TEA(10-3mol/L)没有对橙皮素的舒张幅度产生显著影响；提前预孵电压依赖性钾通道阻断剂4-AP(10-4mol/L)，使橙皮素对60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩肾动脉血管环的舒张幅度分别减弱了14.26%和18.31%。详见图1。

注：*P<0.05，**P<0.01 vs橙皮素。

图1橙皮素(10-6～10-4mol/L)对60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩大鼠肾动脉环的舒张作用

2.3橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾电流(Kv)的影响大鼠肾动脉血管平滑肌细胞Kv电流，在-40 mV开始激活，刺激电压为+60 mV时的电流密度为(32.54±6.02)pA/pF。橙皮素可使大鼠肾动脉血管平滑肌细胞Kv电流的I-V曲线非平行上移，在刺激电压为+60 mV时的电流密度为(47.26±5.37)pA/pF。详见图2。

图2　橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾电流影响

3讨论

橙皮素是天然存在的一类黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中，具有多种生物药理学活性。在心血管系统，橙皮素能够降低血压，舒张大鼠冠状动脉等。本实验结果显示，橙皮素对大鼠肾动脉的静息张力没有显著影响，能够浓度依赖性降低60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE预收缩大鼠的肾动脉张力，最大舒张百分比分别为(53.39±5.27)%和(60.13±4.17)%。

钾通道是钾离子选择性跨膜通过的离子通道，钾通道在调节平滑肌舒缩活性中起重要作用。血管平滑肌上主要存在四种类型的钾通道：Kv、KCa、KIR和KATP。激活钾通道引起细胞膜超极化，引起血管舒张；抑制钾通道可导致细胞膜去极化，引起血管收缩。

本实验观察大电导钙激活钾通道TEA和电压依赖性钾通道阻断剂4-AP对橙皮素舒张大鼠肾动脉的影响。结果显示，提前预孵TEA没有对橙皮素的舒张幅度产生显著影响；提前预孵4-AP，使橙皮素对KCl或PE预收缩肾动脉血管环的舒张幅度分别减弱了14.26%和18.31%。

为了进一步验证橙皮素舒张大鼠肾动脉的作用与电压依赖性钾通道的关系，实验观察橙皮素对大鼠肾动脉血管平滑肌细胞电压依赖性钾通道电流的影响，结果显示橙皮素可使大鼠肾动脉血管平滑肌细胞Kv电流的I-V曲线发生非平行上移。

本研究为临床开发使用橙皮素奠定了理论基础，为橙皮素治疗肾动脉高压提供了依据。

参考文献：

[1]Choi EJ.Antioxidative effects of hesperetin against 7，12-dimethylbenz(a) anthracene-induced oxidative stress in mice [J].Life Sciences，2008，82(21)： 1059-1064.

[2]Li F，Chow S，Cheung WH，et al.The citrus flavonone hesperetin prevents letrozole-induced bone loss in a mouse model of breast cancer [J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2013，24(6)： 1112-1116.

[3]Jin YR，Han XH，Zhang YH，et al.Antiplatelet activity of hesperetin，a bioflavonoid，is mainly mediated by inhibition of PLC-γ2 phosphorylation and cyclooxygenase-1 activity [J].Atherosclerosis，2007，194(1)： 144-152.

[4]Orallo F，Lvarez E，Basaran H，et al.Comparative study of the vasorelaxant activity，superoxide-scavenging ability and cyclic nucleotide phosphodiesterase-inhibitory effects of hesperetin and hesperidin [J].Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology，2004，370(6)： 452-463.

[5]梁泰刚，秦小江，侯晓敏.白杨素对大鼠离体肾动脉的舒张作用 [J].中国药物与临床，2014(8)：1009-1111.

[6]秦小江，侯晓敏.葛根素对大鼠离体冠状动脉血管环的舒张作用及其机制研究 [J].中国药物与临床，2014，1： 36-37.

(本文编辑王雅洁)

通讯作者：韩玲军，E-mail：641292465@qq.com

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.013

文章编号：1672-1349(2016)10-1097-03

(收稿日期：2015-04-16)