HDAC1重组腺病毒载体的构建及鉴定

马珊珊， 张 琨， 邢 衢， 黄团结， 程 康， 关方霞

(郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001)

HDAC1重组腺病毒载体的构建及鉴定

马珊珊， 张 琨， 邢 衢， 黄团结， 程 康， 关方霞

(郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001)

利用Ad-Easy腺病毒表达系统构建含有人源性组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因的重组腺病毒，并检测其在脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)中的表达及对hUC-MSCs增殖的影响.RT-PCR扩增人HDAC1 ORF序列，构建pAdTrack-CMV-HDAC1重组腺病毒穿梭质粒，PmeI单切后将其转化进入E.coliBJ5183与腺病毒骨架质粒同源重组，PacI单切线性化后转染至HEK293 细胞中扩增和包装pAd-HDAC1，采用空斑法鉴定病毒滴度；pAd-HDAC1感染hUC-MSCs，倒置荧光显微镜下观察荧光表达，qRT-PCR和Western Blot分别检测细胞中HDAC1在mRNA水平和蛋白水平的表达，CCK-8实验检测HDAC1高表达对hUC-MSCs增殖的影响.结果显示成功扩增人 HDAC1 ORF 序列并构建pAd-HDAC1重组腺病毒；病毒感染后hUC-MSCs中HDAC1 mRNA和蛋白表达水平明显增高，并且促进hUC-MSCs的增殖.成功构建HDAC1高表达的腺病毒，可有效提高hUC-MSCs中HDAC1的表达并促进细胞增殖.

组蛋白去乙酰化酶1； 腺病毒载体； 脐带间充质干细胞； 增殖

0 引言

组蛋白乙酰化修饰是一种表观遗传修饰，它不改变细胞DNA 序列，通过组蛋白乙酰化酶(histone acetylases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)共同调控基因转录过程，在干细胞增殖、分化以及凋亡等多种生物过程中发挥重要作用[1].哺乳动物细胞中已经发现了18种HDACs[2]，在干细胞增殖和定向分化研究中关注较多的是HDAC1.目前研究较多的是使用基因缺失技术或者化学抑制剂抑制HDAC1的功能，分析其对干细胞分化的影响.研究表明，缺失HDAC1基因导致 ESCs 分化水平提高，并提高 ESCs中心肌细胞、肌肉细胞和神经细胞特异标记基因的表达[3].SAHA(HDAC抑制剂)通过提高心肌和平滑肌发育相关基因启动子的乙酰化水平，促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌和平滑肌细胞定向分化[4].但是HDAC1高表达对人源性脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)的增殖和分化的影响还未见明确报道.为此，本研究利用Ad-Easy腺病毒载体构建含有HDAC1基因的重组腺病毒，并制备出病毒，感染hUC-MSCs，探究改变hUC-MSCs中HDAC1表达活性后对其增殖的影响，为深入研究HDAC1的双向调控对hUC-MSCs增殖和神经分化的影响提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

引物合成、测序、鼠抗人HDAC1、鼠抗人GAPDH抗体在生工生物工程(上海)股份有限公司完成或购买； RNA提取、逆转录、qRT-PCR试剂盒和Western Blot等试剂购自TaKaRa公司.CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术公司； hUC-MSCs为实验室前期分离、鉴定和传代培养的细胞.

1.2 HDAC1重组腺病毒载体的构建和包装

使用Ad-Easy腺病毒载体系统制备HDAC1重组腺病毒载体.RNA提取试剂盒提取hUC-MSCs的总RNA，逆转录合成cDNA，以5′-GATAAGGTACCATGGCGCAGACGCAGGGCAC-3′(正向)和5′-CGGGCAAGCTTTCAGGCCAACTTGACCTCCT-3′(反向，下划线的碱基表示引入的酶切位点)为引物RT-PCR扩增HDAC1 ORF.然后将其插入到穿梭质粒pAdTrack-CMV的KpnI和HindIII位点之间，构成pAdTrack-CMV-HDAC1；测序验证后提质粒，PmeI单切使质粒线性化并将其转化进入E.coliBJ5183菌株中，与腺病毒骨架质粒(pAdEasy1)进行同源重组后获得重组腺病毒质粒pAd-HDAC1；pAd-HDAC1经PacI单切线性化后利用Lipofectamine2000转染至HEK293细胞进行病毒包装.

1.3 pAd-HDAC1重组腺病毒的扩增

HDAC1基因随着重组腺病毒在感染的HEK293细胞中大量扩增.当HEK293细胞出现明显病变时，收集细胞，液氮反复冻融4次，12 000 rpm离心10 min后取上清即可收获大量重组腺病毒.

1.4 重组腺病毒的滴度测定

采用空斑法测定病毒滴度.pAd-HDAC1病毒原液用DMEM/高糖培养基以10倍梯度依次稀释，分别感染对数生长期的HEK293细胞，使病毒稀释液与细胞充分接触，37 ℃细胞培养箱中孵育1 h后，弃培养液，每孔加入1 mL配好的琼脂培养基使其均匀覆盖细胞，待琼脂培养基凝固后将板置于培养箱中继续孵育.每天于固定的时间观察各孔中空斑形成情况，计数一次，待空斑数目稳定不变(约7～10 d)时停止.根据孔中发生完全病变的细胞数量，计算出收集的腺病毒滴度(pfu/L).病毒感染滴度(pfu/L)=相同稀释度空斑均数×稀释倍数/病毒液体积.

1.5 pAd-HDAC1重组腺病毒感染hUC-MSCs

取第3代的hUC-MSCs，待其达到80%融合时，PBS漂洗1次加入感染复数为10 的pAd-HDAC1病毒进行感染(感染组)，以正常培养的P3 hUC-MSCs作为对照组，以pAd-GFP空病毒感染P3 hUC-MSCs作为阴性对照组.将2组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h后倒置荧光显微镜下观察细胞形态和荧光表达情况.

1.6 qRT-PCR检测HDAC1 mRNA的表达

收集上述感染的hUC-MSCs，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH作为内参.按照试剂盒说明书配制qRT-PCR反应体系，每组3个重复孔，利用Fast7500 Real Time System进行PCR，95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环.反应结束后记录扩增曲线和溶解曲线，HDAC1的相对表达量(RQ)=2-ΔΔCt，以Graphpad Prism 5作图.

1.7 Western Blot检测HDAC1蛋白的表达

对上述3组细胞提取总蛋白，测定蛋白浓度后各取100 μg进行SDS-PAGE电泳.切割目的蛋白条带，电转至PVDF膜，然后用50 g/L的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，鼠抗人HDAC一抗(1∶1 000稀释)或鼠抗人GAPDH一抗(1∶500稀释，作为内参)4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次洗去一抗,每次15 min.用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗在室温条件下温孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL化学发光显影成像.

1.8 CCK-8实验hUC-MSCs的增殖

将上述3组细胞浓度调整为3×104/mL,分别取100 μL细胞接种于96孔板，每孔各接种3 000个细胞，每组设5个复孔.分别于1、2、3、4、5天后换成新鲜培养基，避光条件下每孔加10 μL CCK-8溶液并继续培养2 h.酶标仪检测450 nm处的吸光度值，记录数据并绘制细胞的生长曲线.

1.9 数据处理

采用SPSS 18.0进行统计学分析，应用单因素方差分析 3组细胞中HDAC1 mRNA相对表达量和细胞吸光值的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05.

2 结果

2.1 pAd-HDAC1重组腺病毒的构建

提取hUC-MSCs的总RNA，获得浓度较高纯度较好的总RNA(图1A).RT-PCR扩增出大小为1 400 bp左右的条带(图1B)，测序后确定为人HDAC1序列.pAdTrack-CMV-HDAC1质粒与pAdEasy1在BJ5183菌体内同源重组后，PacI酶切鉴定得到1条大于23 kb的腺病毒基因组片段和1条4.5 kb的Ori和氨苄青霉素抗性编码基因片段(图1C)，表明 pAd-HDAC1重组腺病毒质粒已成功构建.

A：P0和P3代表hUC-MSCs总RNA的提取; B:RT-PCR扩增人HDAC1 ORF序列; C: pAd-HDAC1质粒电泳图谱.M：marker；1：pAd-HDAC1重组质粒；2：PacI单切线性化重组质粒pAd-HDAC1.图1 pAd-HDAC1重组腺病毒的构建Fig.1 Construction of recombinant adenovirus pAd-HDAC1

2.2 重组腺病毒pAd-HDAC1的滴度测定

PacI线性化后的pAd-HDAC1，经Lip2000转染至HEK293细胞进行包装和大量扩增.然后利用空斑法计算病毒滴度.在24孔板中接种293细胞，然后用不同浓度的病毒感染细胞，根据孔中发生细胞完全病变的细胞数量，计算出收集的pAd-HDAC1重组腺病毒滴度(pfu/L)约为2.1×1010pfu/ L.

2.3 pAd-HDAC1感染hUC-MSCs及HDAC的表达检测

pAd-GFP和pAd-HDAC1感染hUC-MSCs 48 h后，倒置荧光显微镜下可观察到明显的荧光(图2B、C)，说明腺病毒已经进入hUC-MSCs.qRT-PCR和Western Blot检测显示pAd-HDAC1感染组中HDAC1 mRNA和蛋白的表达明显高于空病毒组和对照组中的表达(图2D、E).该结果说明pAd-HDAC1腺病毒已经进入hUC-MSCs并在细胞中成功表达.

A:正常对照组；B：pAd-GFP组；C：pAd-HDAC1组；D：qRT-PCR检测各组细胞HDAC1 mRNA的表达；E：Western Blot检测HDAC1蛋白的表达.图2 pAd-HDAC1感染hUC-MSCs 48 h后荧光、qRT-PCR和Western Blot检测结果(100×)Fig.2 Fluorescence, qRT-PCR and Western Blot of hUC-MSCs infected by pAd-HDAC1 about 48 h (100×)

2.4 pAd-HDAC1对hUC-MSCs增殖的影响

如图3所示，pAd-HDAC1感染组细胞的增殖速率明显高于对照组细胞(P<0.05)，该结果说明HDAC1高表达能够促进hUC-MSCs的增殖.

图3 各组hUC-MSCs细胞生长曲线Fig.3 The growth curves of hUC-MSCs in different groups

3 讨论

HDACs 通过使组蛋白去乙酰化与其他多种转录因子形成特定的转录复合物，调控基因转录过程导致基因沉默，参与细胞增殖、分化等多种活动[1].研究表明MSCs定向诱导分化过程中，伴随着HDAC1表达水平的下调[5].研究人员发现抑制HDAC的活性能够促进ESCs、NSCs或者MSCs向神经细胞、肝脏细胞、肌肉细胞等多种细胞定向分化[3,4,6-8].因此，为了体外扩增获得足够数量的MSCs而避免MSCs的自发分化，可以通过提高HDAC1的表达而调控干细胞的增殖.

与脂质体介导质粒转染相比，重组腺病毒表达载体[9]具有宿主范围广，感染效率高，毒性低、非整合宿主染色体等优点[10].因此，本研究应用Ad-Easy腺病毒表达载体系统[11]，即以携带 GFP 的腺病毒穿梭质粒(pAdTrack-CMV)和腺病毒骨架质粒(pAd-Easy1)作为载体成功制备含有HDAC1基因的腺病毒.该病毒含有CMV 启动子和GFP基因，可在荧光镜下直接观察感染效果，同时不会整合到宿主细胞基因组中，保证了实验的安全性.qRT-PCR和Western Blot结果显示，pAd-HDAC1感染hUC-MSCs后,HDAC1的mRNA和蛋白表达均明显提高，表明本研究成功构建了HDAC1高表达的腺病毒(pAd-HDAC1)，并在干细胞中表达.CCK-8结果显示,HDAC1高表达能够促进hUC-MSCs的增殖，但是对hUC-MSCs定向分化的影响还需要进一步实验验证.

因此，本研究采用Ad-Easy系统成功构建了携带 GFP 的pAd-HDAC1重组腺病毒，pAd-HDAC1能有效感染hUC-MSCs，并促进MSCs在体外的增殖.该结果为下一步在体内水平研究pAd-HDAC1对hUC-MSCs增殖、定向分化和对神经系统疾病的治疗作用奠定基础，具有重要的研究意义.

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(责任编辑：王浩毅)

Construction and Identification of Adenoviral Vector Containing Human HDAC1 Gene

MA Shanshan， ZHANG Kun， XING Qu， HUANG Tuanjie，CHENG Kang， GUAN Fangxia

(SchoolofLifeScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

It was aimed to construct a recombinant adenovirus containing human histone deacetylase 1 (HDAC1) gene by using Ad-Easy system and detect its effect on the proliferation of hUC-MSCs. Human HDAC1 ORF was generated by RT-PCR and inserted into the shuttle adenovirus plasmid to construct recombinant shuttle adenovirus plasmid (pAdTrack-CMV-HDAC1).The pAdTrack-CMV-HDAC1 was linearized byPmeI and transformed into BJ5183 to homologously recombine with pAdEasy1. After linearized byPacI, pAd-HDAC1 was transfected into HEK293 to package and amplify. The viral titer was determined by air-dilution method. After transfected into hUC-MSCs, the green fluorescence was observed by using fluorescent microscope. qRT-PCR and Western Blot were used to analyze the mRNA and protein expression of HDAC1 and CCK-8 assay was performed to detect the proliferation of hUC-MSCs. Recombinant adenovirus pAd-HDAC1 containing HDAC1 gene was successfully constructed. After transfected into hUC-MSCs, the mRNA and protein expression of HDAC1 in hUC-MSCs were increased significantly, and HDAC1 could promote the proliferation of hUC-MSCs. pAd-HDAC1 was successfully constructed, which can effectively improve expression of HDAC1 in hUC-MSCs and promote hUC-MSCs proliferation.

histone deacetylase 1; adenoviral vectors; umbilical cord mesenchymal stem cells; proliferation

2015-11-15

NSFC-河南人才联合基金项目(U1404313)；国家自然科学基金资助项目(81471306)；河南省高校科技创新团队项目(15IRTSTHN022)；河南省科技创新人才计划项目(154200510008).

马珊珊(1984—)，女，河南开封人，副教授，博士，主要从事干细胞与神经修复研究，E-mail: mashanshan84@163.com；通讯作者：关方霞(1969—)，女，河南洛阳人，教授，博士，主要从事干细胞与再生医学研究，E-mail: guanfangxia@126.com．

马珊珊，张琨，邢衢，等．HDAC1重组腺病毒载体的构建及鉴定[J]．郑州大学学报(理学版)，2016，48(2)：101-104．

R394.2

A

1671-6841(2016)02-0101-04

10.13705/j.issn.1671-6841.2015259