发酵条件对红曲产洛伐他汀的影响

张江宁，丁卫英，杨　春

（山西省农业科学研究院农产品加工研究所，山西太原　030006）



发酵条件对红曲产洛伐他汀的影响

张江宁，丁卫英，杨春

（山西省农业科学研究院农产品加工研究所，山西太原030006）

摘要：试验从红曲霉固态发酵条件入手，通过选择不同碳源和氮源，研究其对洛伐他汀产量的影响，最终确定以葡萄糖和蛋白胨作为辅助碳源和氮源，此时洛伐他汀产量最高。

关键词：发酵条件；红曲霉；洛伐他汀

0　引言

红曲在我国有着悠久的历史，主要应用于发酵食品、色素等方面。近年来，红曲霉的次级代谢物洛伐他汀成为研究的热点，它是一种胆固醇合成抑制剂，能有效地抑制胆固醇生物合成过程中关键酶HMG- Co还原酶的活性［1］。洛伐他汀产量受培养基［2］和培养条件的影响很大，在条件不适时产量极微，甚至不产生。因此，本试验从红曲霉固态发酵条件入手，通过选择不同碳源和氮源，研究其对洛伐他汀产量的影响，为科学利用红曲霉提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料

菌种，安卡红曲取自中国典型培养物保藏中心。

1.2仪器和试剂

SW- CJ- 2G型超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；GMSX- 280型高压灭菌锅，北京市永光明医疗仪器厂产品；甲醇（色谱纯），天津市康科德科技有限公司产品；95%乙醇（分析纯），莱阳经济技术开发区精细化工厂产品。

洛伐他汀，配置成200 mg/L的标准溶液；乙醇提取液（75%）的配制为25 mL蒸馏水中加入无水乙醇75 mL，混匀；中性氧化铝预处理柱用中性氧化铝置于130℃烘箱中烘烤4 h，使用前称5 g装柱（玻璃柱），用10 mL甲醇活化。

1.3培养基

斜面培养基采用土豆培养基；种子液培养基（g/L）为葡萄糖60 g，蛋白胨20 g，NaNO310 g，MgSO4·7H2O 5 g，KH2PO410 g，121℃灭菌20 min［3］；固态发酵培养基：大米经清洗，放置于水中浸泡15 h后取出，蒸煮至大米颗粒分散、微黏状态。蒸煮后的大米置于塑料发酵培养瓶中，于121℃，0.1 MPa的灭菌锅内灭菌30 min。

1.4培养方法

（1）试管斜面菌种培养。挑取1环贮藏菌种接种于斜面培养基中，于31℃恒温箱中扩大培养1周，置于4～5℃冰箱中贮藏备用。

（2）孢子悬液的制备。斜面种子试管加无菌生理盐水，将孢子刮下置于三角瓶中。以转速200 r/min在摇床上放置0.5～1.0 h，观察孢子状态，孢子完全活化分散开后，用无菌脱脂棉过滤孢子液，滤液即为单孢子悬液，最后将孢子稀释至质量分数约为1× 106～1×107个/ mL。

（3）固态发酵。将三角瓶中的孢子悬液按照一定的接种量接种，于装有50 g固态发酵培养基的250 mL培养容器中，于30℃恒温培养20 d［4］。

1.5洛伐他汀含量测定方法［5］

1.5.1色谱条件

色谱柱采用Phenomenex kromasil 5U 100A C18型，250 mm×4.6 mm×5 μm；流动相为甲醇+水（90+ 10），流速1.0 mm/min，压力140 Bar，波长237 nm，保留时间5～6 min，进样体积10 μL；该方法检出最小质量分数为2 mg/kg。

1.5.2测定步骤

（1）标准曲线配制。用洛伐他汀标准溶液200mg/L逐级配制0，0.04，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00 mg/L标准系列。

（2）样品处理及测定。准确称取混匀样品1.0 g 于25 mL容量瓶或试管中，加入乙醇提取液15 mL左右（平行做3份），超声波提取30 min，补加提取液至刻度，收集滤液。准确吸取滤液5.0 mL，通过预先活化好的中型氧化铝小柱，用9.0 mL甲醇（3.0，3.0，3.0 mL分3次）洗脱。收集洗脱液定容10.0 mL，用高效液相色谱测定。通过被测样品液组分与标准液保留时间对比进行定性，利用被测样品液组分的峰面积与标准液峰面积对比进行定量。

（3）结果计算。

1.6培养条件对洛伐他汀产量的影响

1.6.1碳源种类对洛伐他汀产量的影响

分别添加5%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油［6］、玉米粉为附加碳源，按照固态发酵方法进行固态发酵，通过1.5中的检测方法检测洛伐他汀的含量。

1.6.2氮源种类对洛伐他汀产量的影响

分别添加2%的有机氮源大豆粉［7］、蛋白胨［8］、酵母膏，以及无机氮源NaNO3［9］，NH4NO3，NH4Cl为附加氮源。

2　结论

2.1碳源种类对洛伐他汀产量的影响

碳源是红曲霉生长代谢重要的物质之一，提供菌体代谢所需要的能量，同时也是构成菌体细胞及各种代谢产物的主要成分。

碳源种类对洛伐他汀产量的影响见图1。

由图1可知，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作为附加碳源时都能不同程度的增加，其中葡萄糖作为附加碳源时洛伐他汀的产量最高，达到13.6 mg/g，有显著差异，因此葡萄糖是该菌株固态发酵的最适碳源。

2.2氮源种类对洛伐他汀产量的影响

图1　碳源种类对洛伐他汀产量的影响

氮在微生物的生长代谢中具有重要的作用，因为氮元素是构成微生物细胞内核酸和蛋白质的重要成分。因此，在微生物生长过程和代谢产物的合成过程中，氮源也是必须的。以固态发酵培养基为基本培养基进行发酵，检测洛伐他汀的含量，以蛋白胨为附加氮源洛伐他汀的产量最高，与其他几种氮源相比差异比较明显。大豆粉与酵母膏之间差异不显著，NaNO3与NH4Cl之间差异也不显著，总体来讲有机氮源洛伐他汀产量大于无机氮源，因此选择影响最大的蛋白胨作为固态发酵生产洛伐他汀的氮源。

氮源种类对洛伐他汀产量的影响见图2。

图2　氮源种类对洛伐他汀产量的影响

3　结论

本试验通过对洛伐他汀固态发酵条件的分析，确定了分别以葡萄糖和蛋白胨作为发酵生产洛伐他汀的辅助碳源和氮源，此外还有一些其他因素对发酵产物也有着不可忽视的影响。例如，接种量大小、发酵温度与发酵时间，同时红曲中的洛伐他汀含量达到较高值时，其中的毒害物质桔霉素含量的高低也是应关注的关键点，在以后的工作中有待进一步研究。

参考文献：

［1］沈平，伍军，李浩然，等.红曲固态发酵生产洛伐他汀的实验条件优化［J］.北京农学院学报，2005（3）：47-79.

［2］童爱均，吕旭聪，刘晓艳，等.固体发酵基质和外加碳氮源对红曲霉色素产量的影响［J］.中国调味品，2015（5）：5-10.

［3］陈勉华，吉达维，马人杰，等.不同发酵基质对红曲重要代谢产物的影响［J］.中国酿造，2013（3）：22-24.

［4］许赣荣，陈晔，陈蕴，等.无桔霉素高比例开环式莫纳可林K红曲产品的生产［J］.食品与发酵工业，2004（10）：59-63.

［5］罗仁才，孙开奇，谢申猛，等.红曲中洛伐他汀总量的测定方法［J］.卫生研究，2003（2）：157-158.

［6］Miyake T，Uchitomi K，Zhang M Y，et al. Effects of the principal nutrients on lovastatin production by monascus pilosus［J］. Biosci Biotechnol Biochem，2006，70（5）：1 154-1 159.

［7］熊晓辉，张李阳，韦策，等.红曲霉菌产Monacolin K固体发酵条件的优化［J］.无锡轻工大学学报，2004，23（1）：9-13.

［8］董永胜，刘同军，贾士儒，等.红曲霉固态发酵生产Monacolin K工艺条件的研究［J］.食品研究与开发，2007（6）：27-30.

［9］童振字，周立平，陈旭峰.响应面法优化红曲霉菌株Monascus purpureus WX液态发酵产Monacolin K工艺条件［J］.浙江工业大学学报，2007（1）：35-40.

Effects of Fermentation Conditions of Monascus Lovastin Production

ZHANG Jiangning，DING Weiying，YANG Chun
（Agricaltural Products Processing Research Insitute，Shanxi Acadeing of Agricultural Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Abstract：In this experiment，the operational factors on lovastatin in yield by solid- state fermentation are studied，the result show that the optimum conditions is glucose and peptone as additive carbon source and nitrogen source.

Key words：fermentation；monascus；lovastatin

中图分类号：TQ463

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.014

文章编号：1671- 9646（2016）05a- 0050- 02

收稿日期：2016- 01- 30

基金项目：山西省青年科技研究基金项目（2015021144）。

作者简介：张江宁（1981—），女，硕士，助理研究员，研究方向为食品科学。