应用实时荧光定量PCR技术探讨B群链球菌与胎膜早破的关系*1

2016-06-23杨坤祥王芬芳钟泽艳

国际检验医学杂志 2016年10期

关键词：胎膜早破

杨坤祥，王芬芳，钟泽艳

(惠州市第一妇幼保健院检验科，广东惠州 516003)

·临床研究·

应用实时荧光定量PCR技术探讨B群链球菌与胎膜早破的关系*1

杨坤祥，王芬芳，钟泽艳

(惠州市第一妇幼保健院检验科，广东惠州 516003)

摘要:目的探讨应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测B群链球菌与胎膜早破之间的关系。方法将300例发生胎膜早破的孕妇设为研究组，300例未发生胎膜早破的孕妇设为对照组，采集孕妇宫颈分泌物，用实时荧光定量PCR法和细菌培养法检测B群链球菌。结果对照组宫颈分泌物检测B群链球菌阳性率为7.00%(21/300)；研究组宫颈分泌物检测B群链球菌阳性率为20.00%(60/300)。实时荧光定量PCR法检测B群链球菌阳性率为13.50%(81/600)；显色细菌培养法检测B群链球菌阳性率为10.00%(60/600)；传统细菌培养法检测B群链球菌阳性率6.67%(40/600)。结论围生期孕妇生殖道B群链球菌感染与胎膜早破的关系密切，应加强孕晚期B群链球菌的筛查，降低发生胎膜早破的风险。实时荧光定量PCR技术检测B群链球菌的阳性率明显高于细菌培养法，且用时短，准确度高。尽早检出B群链球菌感染有可能降低或预防胎膜早破的发生。

关键词:聚合酶链反应；B群链球菌；胎膜早破

B群链球菌(GBS)学名为无乳链球菌，能引起牛乳房炎，严重危害畜牧业。现发现该菌也能感染人类，尤其是新生儿，可引起败血症、脑膜炎、肺炎等，病死率极高，并可产生神经系统后遗症，被医学界重视。GBS正常寄居于下呼吸道、泌尿生殖道和直肠，带菌率达30%，健康人的鼻咽部也可分离到GBS。新生儿感染跟母体带菌有密切关系，分娩时胎儿可经带菌产道而被感染，也可由医护人员呼吸道所带病菌传播引起[1]。国内文献报道，围生期孕妇GBS感染率为3.4%～19.01%，新生儿感染率1.40%～9.95%[2-5]。感染率的不同可能与国家地区、种族基因、年龄、教育程度、培养技术及培养频率不同有关。本研究对300例未发生胎膜早破的孕妇(对照组)和300例发生胎膜早破的孕妇(研究组)采取3种筛查方式，研究GBS与胎膜早破之间的关系，旨在尽早筛查出围产期孕妇的GBS感染情况，以期降低胎膜早破的发生率。现将具体过程及结果报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料将2015年1～8月到本院住院分娩的600例孕妇设定为研究对象，将发生胎膜早破的300例孕妇设为研究组，未发生胎膜早破的产妇300例设为对照组。全部孕妇在自愿并完全了解检测目的与研究目的的前提下参与本次研究。

1.2仪器和试剂美国ABI7500实时荧光定量PCR扩增仪；上海力申公司HF90/hf240 CO2培养箱；法国生物梅里埃VITEK2-compact分析仪；GBS核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、阴阳性对照均由福建泰普生物科学有效公司提供；哥伦比亚血琼脂平板由江门凯林有限公司提供；GBS显色平板由郑州安图生物有限公司提供；马尿酸钠生化微量管由杭州天河微生物试剂公司提供；采用金黄色葡萄球菌(ATCC29523)作为质控标准菌种，来自卫生部临检中心。

1.3诊断标准胎膜早破的定义参照全国高等医学院校教材《妇产科学》中有关诊断定义[6]。孕妇符合下列之一即可诊断为胎膜早破：(1)孕妇自觉有大量液体自阴道流出；(2)酸碱试纸测定阴道分泌物pH>7；(3)阴道液涂片烘干后镜检可见羊齿状结晶；(4)阴道液沉渣涂片镜检可见毳毛。

1.4方法

1.4.1标本采集按照GBS核酸检测试剂盒标本采集要求，孕妇取膀胱截石位，常规消毒外阴，灭菌窥阴器扩开阴道暴露宫颈，用棉球擦去宫颈口黏液，分别将3支无菌长棉签分别插入宫颈口内1.5～2.0 cm，转动1圈停留30 s后，取宫颈分泌物置无菌试管中立即送检。将其中一支按以上方法采集的宫颈分泌物标本按临床微生物学检验常规方法(以下称为“传统培养法”)接种于哥伦比亚血平板进行培养；另一只宫颈分泌物标本接种于B群链球菌显色平板(以下简称为“显色培养法”)进行培养，两个平板都置于35 ℃，5% CO2培养箱，孵育24 h后观察血平板上的菌落形态及β溶血现象和显色平板的显色情况，发现可疑菌落后进行触酶试验、CAMP试验和马尿酸钠水解试验，最后用VITEK2-compact分析仪确证鉴定。

1.4.2实时荧光定量PCR反应检测将其中一支宫颈分泌物标本按试剂盒要求提取分泌物中细菌的DNA(以下简称为荧光PCR法)，上清液用于PCR扩增，在ABI7500 PCR扩增仪上按下列循环参数进行扩增反应：stage 1，37 ℃，2 min；stage 2，94 ℃，2 min；stage 3,94 ℃，15 s，55 ℃，45 s；共40个循环，在stage 3，55 ℃，45 s末端收集荧光，反应体积50 μL。

1.5统计学处理采用SPSS18.0统计学软件包进行数据的统计分析，3种检验方法检测结果分别按配对设计下两组频数分布的χ2检验进行比对，对照组和研究组GBS阳性发生率按完全随即设计下两组频数分布的χ2检验进行比对。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.13种检验方法检测GBS阳性率比较对照组和研究组共600例产妇中，荧光PCR法GBS阳性数81例，筛查阳性率为13.50%；显色培养法GBS阳性数60例，筛查阳性率为10.00%；传统培养法GBS阳性数40例，筛查阳性率为6.67%。3种检验方法检测结果两两之间GBS阳性率比较采用Fisher精确检验，检验水准校正为0.017(α=0.05/3=0.017)。可以认为3种方法检验出GBS的阳性概率不相等，且荧光PCR法检测GBS筛查阳性率高于显色培养法和传统培养法，且差异具有统计学意义(P<0.017)。见表1。

2.2对照组和研究组的B群链球菌检测结果由于荧光PCR法的检测阳性率和准确率都比显色培养法和传统培养法要高，所以选用荧光PCR法的检测结果作为参考标准。对照组300例产妇中，GBS检出21株，阳性率为7.00%；研究组300例产妇中，GBS检出60株，阳性率为20.00%。故发生胎膜早破的产妇的GBS阳性率高于未发生胎膜早破的产妇，且差异具有统计学意义(χ2=27.708，P=0.000)。

表1　　3种GBS检验方法结果比较[n(%)]

3讨论

本研究结果显示，荧光PCR法检测GBS的筛查阳性率(13.50%)高于细菌培养法(10.00%和6.67%)，检测结果高于王丽等[7]报道的9.40%和5.80%。3种方法在GBS阳性检出率上差异有统计学意义(P<0.017)，且荧光PCR法的阳性检出率高于细菌培养法。另一方面，荧光PCR法用时短，平均7 h可以完成检测，而细菌培养法要平均48 h才能完成检测，可为尽早诊断提供依据，争取宝贵的治疗时间。

研究结果显示，胎膜早破组宫颈分泌物GBS阳性检出率为20.00%，未发生胎膜早破组宫颈分泌物GBS阳性检出率为7.00%，本研究结果低于李小梅等[8]报道的29.59%和11.93%，也低于李晓英等[9]报道的为29.3%和11.7%，可能跟地区差异、试验方法，采样水平等有关。本研究中，发生胎膜早破的产妇的GBS阳性检出率高于未发生胎膜早破的产妇，且差异具有统计学意义(P<0.05)，说明GBS在生殖道内过量繁殖是围产期孕妇发生胎膜早破的诱因之一，GBS与胎膜早破的关系十分密切，完整的胎膜对病原体的入侵具有屏障作用，若胎膜受到感染，往往会导致胎膜早破。在感染的众多病原体中，由于GBS对绒毛膜的吸附和穿透能力最强，所以危害也最大。寄居在宫颈、阴道、直肠和尿道等处的GBS可上行至胎膜，从而使胎膜感染，并可以通过炎性细胞的吞噬作用和细菌产生的蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部张力降低，从而导致胎膜早破[10-12]。

近年来，世界各地学者对GBS进行大量研究，多数学者认为GBS与围生期感染有关，在孕晚期对所有孕妇进行筛查非常必要。实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、准确性好、用时短等特点，适合在医院进行GBS的筛查，特别是对于已发生胎膜早破的孕妇，应尽早完成检测，及时进行预防性治疗。

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