HPLC法测定补气生血口服液中三种组分的含量

汪　洋，陈　璐，李晋奇，边　原，胡　远

HPLC法测定补气生血口服液中三种组分的含量

汪洋1，陈璐2*，李晋奇2，边原2，胡远2

1.成都市食品药品检验研究院，成都610045；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，成都610072

[摘要]目的建立以高效液相色谱测定补气生血口服液中黄芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸含量的方法。方法三组分均采用phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；黄芪甲苷测定的流动相为水-乙腈(60∶40)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；ELSD检测器；漂移管温度：105 ℃；气流速度：2.5 L/min。二苯乙烯苷与阿魏酸测定流动相为乙腈-水(20∶80)；流速1.0 mL/min；检测波长：248 nm；柱温30 ℃。结果补气生血口服液中黄芪甲苷在0.22～5.72 μg/mL范围内线性关系良好，加样回收率为91.2%。在相同色谱条件下，二苯乙烯苷与阿魏酸分离度好，二苯乙烯苷在9.83～393.00 μg/mL范围内、阿魏酸在1.015～50.756 μg/mL范围内线性关系良好，加样回收率分别为90.7%和92.8%。结论该方法简便、快捷、专属性强，为其质量控制与含量测定提供了重要参考。

[关键词]补气生血口服液；HPLC法；黄芪甲苷；二苯乙烯苷；阿魏酸

0引言

补气生血口服液为四川省人民医院医院制剂，常用于斑秃及脂溢性脱发等，具有增强免疫的功能，至今已有十余年历史[1]。但该制剂以往的质量标准只有外观性状、相对密度、酸碱度以及鉴别项检查，而缺少含量检测项，不利于该制剂的质量控制。因此，本文采用HPLC法测定补气生血口服液中黄芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸的含量，并以此为根据，建立控制该口服液质量的方法，现报道如下。

1仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，岛津LC-10ATvp液相色谱仪。黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110781-200613)、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(批号：110844-201109，含量测定用，含量94.7%，中国食品药品检定研究院)、阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201012，含量：99.6%)，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。补气生血口服液(自制，批号：20140831、20140706、20140610)。

2方法与结果

2.1色谱条件及系统适应性实验

2.1.1黄芪甲苷色谱柱：phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水-乙腈(60∶40)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；ELSD检测器(型号：Alltech 2000)；漂移管温度：105 ℃；气流速度：2.5 L/min。黄芪甲苷出现较好色谱峰，峰型良好。

2.1.2二苯乙烯苷和阿魏酸色谱柱：phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:乙腈-水(20∶80)，流速:1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：248 nm，进样量：10 μL。在此条件下，供试品中二苯乙烯苷和阿魏酸均出现较好的色谱峰，两组分分离完全。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥24 h的黄芪甲苷对照品14.30 mg，加甲醇稀释至250.0 mL，制成57.2 μg/mL的对照品储备液。精密称取二苯乙烯苷对照品9.825 mg，加甲醇溶解后置25 mL量瓶中，并定容至刻度，得浓度为393.0 μg/mL的对照品储备液。取经五氧化二磷减压干燥18 h的阿魏酸对照品12.74 mg，加甲醇稀释至50.0 mL，制成253.781 μg/mL的对照品储备液。

2.2.2供试品溶液的制备①黄芪甲苷[2]：取补气生血口服液2.0 mL，加入2 mL水饱和后的正丁醇，涡旋1 min，静置，分取上层正丁醇液1.5 mL于另一试管中。将剩下的溶液重复提取3次，合并正丁醇液，加入2 mL氨试液，涡旋1 min，2 500 r/min离心2 min，分离弃去氨水层，重复提取2次后，正丁醇层85 ℃水浴氮气吹干，加入200 μL甲醇复溶后，10 μL进样。②阿魏酸和二苯乙烯苷：取补气生血口服液0.5 mL，精密加入1.5 mL甲醇，摇匀，稀释液经0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液10 μL进样。

2.2.3空白供试品溶液的制备取处方比例辅料，按复方黄芪口服液制备工艺分别制得黄芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸3种空白口服液，再按“2.2.2”项下制备方法制得其3种成分对应的空白供试品溶液。

2.3方法学验证

2.3.1线性关系考察①黄芪甲苷：取黄芪甲苷甲醇储备液，加甲醇稀释，制成浓度分别为5.72、3.43、1.72、0.86、0.43、0.22 μg/mL的对照品溶液。分别取10 μL进样，测定黄芪甲苷峰面积。②二苯乙烯苷：精密取“2.2.1”项下的二苯乙烯苷对照品储备液7.0、5.0、2.5、1.3、0.6、0.25 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。得浓度分别为393.00、275.10、196.50、98.75、51.09、23.58、9.83 μg/mL的对照品溶液。分别取10 μL进样，测定二苯乙烯苷峰面积。③阿魏酸：精密取“2.2.1”项下阿魏酸对照品储备液5.0、3.0、1.5、0.5、0.2、0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。得浓度分别为50.756、30.454、15.227、5.076、2.030、1.015 μg/mL的对照品溶液。分别取10 μL进样，测定阿魏酸峰面积。

以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标分别对以上3种组分进行线性回归，回归方程、相关系数与测定范围见表1。

表1　三种组分标准曲线的回归方程、相关系数及测定范围

2.3.2专属性实验色谱图见图1、图2。

图1　黄芪甲苷HPLC法色谱图

图2　二苯乙烯苷与阿魏酸HPLC法色谱图

2.3.3稳定性实验取3个组分对照品溶液与补气生血口服液样品，分别在0、1、2、6、12、24 h测定3个组分峰面积。按“2.1”项色谱条件进样分析，求得在24 h内黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸对照品溶液峰面积的RSD值分别为1.47%、2.13%、1.98%，结果表明，在24 h内样品溶液中3个组分的含量是稳定的。

2.3.4精密度实验分别将黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸对照品溶液重复测定6次，计算黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的RSD分别为2.26%、1.79%、2.51%，说明精密度良好。

2.3.5重复性实验[3]取补气生血口服液6瓶(批号：20140831)，倾出内容物，按“2.2.2”项下分别精密量取适量口服液，分别制备3个组分供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件，分别测定黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的峰面积，乘以其稀释倍数，再计算浓度。黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的RSD(n=6)分别为1.45%、0.78%、0.91%。

2.3.6加样回收率实验[4]取补气生血口服液6瓶(批号：20140831)，倾出内容物，按“2.2.2”项下分别精密量取适量口服液，精密加入对应的对照品，分别制备3个组分供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件，分别测定黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的峰面积，乘以其稀释倍数，再计算浓度。测得加样回收率分别为91.2%、90.7%、92.8%，RSD分别为2.34%、2.75%、2.08%。

2.4样品测定取补气生血口服液3批各6瓶，倾出内容物，按“2.2.2”项下制备3个组分供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件，分别测定其黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的峰面积，乘以其稀释倍数，即得浓度。补气生血口服液样品中黄芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸浓度见表2。

表2　补气生血口服液3个组分含量测定(μg/mL)

3讨论

3.1补气生血口服液由四川省人民医院使用多年的经验方提炼而成，由黄芪、当归、制何首乌、枸杞子、党参5味药材组成，具有养血活血、增强免疫与造血功能的功效。其中黄芪为君药，当归与制何首乌为臣药，本文用HPLC法对该口服液中君药、臣药的主要成分进行含量检测，为补气生血口服液的质量控制提供了重要参考[5]。

3.2二苯乙烯苷存在顺式与反式2种异构体，一般以反式体存在。反式体的最大吸收波长为322、236 nm，而阿魏酸最大吸收波长为323 nm[6]。经试验发现，在同一色谱条件下，波长248 nm处，二苯乙烯苷与阿魏酸的峰型对称性与分离度良好，且在出峰位置无杂质干扰，故选用248 nm为测定波长。

3.3在同时测定二苯乙烯苷、阿魏酸含量时，笔者根据文献[7-8]比较了多种流动相系统，包括乙腈-水(25∶75)、乙腈-0.1%乙酸水(25∶75)、乙腈-水(20∶80)，结果表明，采用乙腈-水(20∶80)后基线平稳，二苯乙烯苷峰型好，各峰均没有拖尾，故选择流动相为乙腈-水(20∶80)。

3.4黄芪甲苷的测定方法较多，包括分光光度法、薄层扫描法、高效液相-紫外检测法、HPLC-ELSD法等[8]。HPLC-紫外检测法对于仅有末端吸收的皂苷类化合物，杂质干扰较大，吸收较弱，准确度较差。HPLC-ELSD法适于仅有末端吸收或无紫外吸收的皂苷类化合物的测定，其不依赖于样品的光学特性，不受官能团影响，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，适合用于测定黄芪甲苷的含量。因此可采用HPLC-ELSD法测定补气生血口服液中黄芪甲苷的含量[9]。

参考文献：

[1]陈勇,王亚非.黄芪注射液辅助雷替曲塞联合奥沙利铂治疗晚期结直肠癌[J].中国新药与临床杂志,2014,33(3):218-221.

[2]杨素芹,刘文惠,张继敏,等.液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中黄芪甲苷及其药动学[J].中国新药与临床杂志,2011,30(9):705-709.

[3]王娟,汪选斌,李洪亮,等.HPLC法测定补肾化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的含量[J].实用药物与床,2015,18(9):1082-1083.

[4]樊建霜,王家员,林方芬,等.HPLC法测定四逆清带口服液中芍药苷的含量[J].实用药物与临床,2015,18(3):310-312.

[5]李琼,曾锐,杨学森.参芪胶囊质量标准研究[J].时珍国医国药,2014,25(1):100-102.

[6]孙晋苓,黄晓兰,吴惠勤,等.何首乌中顺式和反式-二苯乙烯苷的HPLC/DAD/MS测定及其光稳定性考察[J].中国中药杂志,2009,44(7):541-544.

[7]张凤瑞,周贤,刘炎,等.当归补血汤中当归的鉴别及阿魏酸的含量测定[J].时珍国医国药,2014,25(1):98-100.

[8]钟华,李毅,周淑芳,等.高效液相色谱-蒸发光散射测定杞黄颗粒中黄芪甲苷的含量[J].时珍国医国药,2007,18(2):401.

[9]李毅,王颖,张廷模.活血散结合剂中黄芪甲苷含量的测定[J].时珍国医国药,2011,22(3):768-769.

Content determination of three in gradients in buqi shengxue oral liquid by HPLC

WANG Yang1,CHEN Lu2*,LI Jin-qi2,BIAN Yuan2,HU Yuan2

(1.Chengdu Institutes of Food and Drug Control,Chengdu 610045,China; 2.Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People′s Hospital,Chengdu 610072,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,ferulic acid and astragaloside Ⅳ in buqi shengxue oral liquid.MethodsThe content of three ingredients was determined by phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) chromatographic column.The content of astragaloside was determined by HPLC with the mobile phase of acetonitrile-water (40∶60),the column temperature was 30 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min,and the sample size was 10 μL; ELSD detector was used; the drift tube temperature was 105 ℃,and the air speed was 2.5 L/min.HPLC was adopted to determine the content of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside and ferulic acid with methanol-water (20∶80) as mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min with the detection wavelength of 248 nm,and the column temperature was 30 ℃.ResultsThe calibration curve had good linear relationship in the range of 9.83～393.00 μg/mL for 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucoside,1.015～50.756 μg/mL for ferulic acid,0.22～5.72 μg/mL for astragaloside Ⅳ.The average recovery was 90.7%,92.8% and 91.2%.ConclusionThe method is accurate and reliable,which can be used for the quality control and content determination of buqi shengxue oral liquid.

Key words：Buqi shengxue oral liquid; HPLC; AstragalosideIV; 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside; Ferulic acid

收稿日期：2015-09-21

基金项目：四川省中医药管理局青年中医药课题(2010-64)；四川省人民医院2014年苗圃计划

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605025