HPLC法测定注射用腺苷钴胺有关物质

王金柱+徐莹莹

摘 要：目的：采用高效液相色谱法（HPLC法）测定注射用腺苷钴胺有关物质含量。方法：应用C18色谱柱，流动相选磷酸二氢钾-乙腈（PH调节采用磷酸，并将PH控制在3.2），最佳流速为1.0mL·min-1，柱温控制在30摄氏度左右；检测波长260nm，进样量10μL；以此测定注射用腺苷钴胺中有关物质的含量。结果：实验中精密度及准确度等全部符合样品分析的要求。其中，腺苷钴胺、氰钴胺与相邻峰的分离度佳，其线性范围分别是100～0.2μg·mL-1（R=0.9999）、10～0.1μg·mL-1（R=10000）。结论：HPLC法操作过程简单、快速，精密度及准确率高，专属性强，能够良好的测定注射用腺苷钴胺有关物质含量，值得推广。

关键词：注射用腺苷钴胺；HPLC法；有关物质；氰钴胺

注射用腺苷钴胺为抗贫血药，可用于贫血（巨幼红细胞性、营养不良性、妊娠期）、神经根炎、三叉神经炎、坐骨神经痛、神经麻痹、多发性神经炎等疾病的辅助治疗，也可以用于营养性神经疾患及由于放射线或药物所引起的白细胞减少症等[1]。腺苷钴胺是維生素B12在人体内的活性辅酶之一，是细胞生长及繁殖、维持神经髓鞘完整性的必需物质之一[2]。然而，腺苷钴胺缺点在于对酸、碱、光的不稳定性，且在制备过程中多产生杂质氰化钴胺[3]。氰化钴胺在结构上含有氰根这种剧毒性结构，其不能作为注射药物。注射用腺苷钴胺有关物质的测定利用吸光度法对药品中氰化钴胺一类已知杂质加以控制，因此， 运用恰当的方法测定注射用腺苷钴胺内有关物质含量，来更加严格的控制药品质量，保证药品安全是十分重要的。

1 仪器与试剂、药品

1.1仪器

电子天平，高效液相色谱仪。

1.2 试剂与药品

腺甘钴胺标准品；氰钴胺对照品；注射用腺甘钴胺样品；色谱纯：乙腈；分析纯：磷酸二氢钾、磷酸。

2方法

2.1.溶液的制备[4]

取腺甘钴胺加水分别稀释成含腺甘钴胺1.0mg/mL和25μg/mL对照溶液，取氰钴胺药品，加水制备成含氰钴胺2μg/mL的溶液作对照品溶液。

2.2色谱条件[5]

色谱柱为C18色谱柱；检测波长260nm；柱温大概控制在30摄氏度左右；流动相选磷酸二氢钾-乙腈，选用磷酸来调节PH值，并将PH值大约控制在3.2。最佳流速设置为1.0mL·min-1；每次注入药量为10μL。

2.3方法

取用10μL对照溶液注入高效液相色谱仪中，并调节好灵敏度，令主成份的峰高可以达到总量程的20%-25%之间。精密测量并取用供试品溶液，对照用溶液及氰化钴胺对照品溶液，每种各为10μL，且将其分别注进高效液相色谱仪中，观察并记录色谱图，并记下色谱图达到主成分峰的保留时间的2.5倍。如果供试品溶液色谱中出现了与氰钴胺相对应的峰，则要求含量小于1.0%，而供试品溶液中各种杂质的峰的面积的和必须小于等于主峰面积的两倍。

2.4最低检测限与定量限试验

2.4.1腺苷钴胺的检测限及定量限

利用电子天平精确称取腺苷钴胺对照品，并对其加水进行稀释，在已选定好的色谱条件下进行检测。当腺苷钴胺的信噪比达到10：1时，可计算出腺苷钴胺的定量限约为0.915ng，而在信噪比为3：1的时候，计算出的腺苷钴胺的定量限大概是0.57。

2.4.2氰钴胺的检测限和定量限

利用电子天平精确称取氰钴胺对照品，并对其加水进行稀释，在已选定好的色谱条件下进行检测。当氰钴胺的信噪比达到10：1时，可计算出腺苷钴胺的定量限约为0.915ng，而在信噪比为3：1的时候，计算出的氰钴胺的定量限大概是0.57。

3 结果

实验中精密度及准确度等全部符合样品分析的要求。其中，腺苷钴胺、氰钴胺与相邻峰的分离度佳，其线性范围分别是100～0.2μg·mL-1（R=0.9999）、10～0.1μg·mL-1（R=10000）。

4 讨论

腺苷钴胺是维生素B12在人体内的活性辅酶之一，是细胞生长及繁殖、维持神经髓鞘完整性的必需物质之一，腺甘钴胺常被用来治疗巨幼细胞性贫血、妊娠期贫血等，还被用来辅助治疗各类神经炎等神经性疾病[6-9]。但是，其成分内的有关物质的相关研究文献较少。而其中，氰钴胺及羟钴胺是现阶段已知的注射用腺甘钴胺成分中的杂质[10-12]。由于药物的生产工艺的改变，其中的杂质物质不能够有效的分离出去[13]。因此，为达到提高腺甘钴胺主成分峰与杂质峰的分离度的目的，本文设计的实验则是选用适合于HPLC法条件的样品，改善有关物质和待测成分的分离的效果，并控制总的杂质与氰钴胺。

HPLC法方法简单，操作便利、快捷，且具有很高的灵敏度，准确度、检测限与定量限全部附合相关要求，适合用于控制注射用腺甘钴胺有关物质，值得推广[14-15]。

参考文献

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作者简介：王金柱，哈尔滨三联药业股份有限公司，工程师，150025，本科，1989年03月03日，药品质量方向。