幽门螺杆菌的细胞内感染及机制研究进展

高采平，韩盛玺

(四川省医学科学院·四川省人民医院消化内科，四川 成都 610072)

幽门螺杆菌的细胞内感染及机制研究进展

高采平，韩盛玺△

(四川省医学科学院·四川省人民医院消化内科，四川 成都 610072)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一种主要定植于人胃黏膜的革兰氏阴性菌，与多种胃内外疾病密切相关，曾被认为是一种胞外致病菌，然而，越来越多的研究发现H. pylori可以进入细胞内存活、复制，可能为兼性胞内菌。而且，细胞内感染可能在H. pylori致病及耐药方面起重要作用。本文回顾了H. pylori的细胞内感染及机制研究进展。

幽门螺杆菌；细胞外感染；细胞内感染；自噬异常

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一种主要定植在人类胃黏膜小凹中、并能够引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及胃黏膜组织相关淋巴瘤(MALT淋巴瘤)等严重病变的螺旋状细菌。1983年，澳大利亚科学家Warren和Marshall首次从人类胃黏膜组织中分离培养出H. pylori[1]；1994年，H. pylori被世界卫生组织定义为Ⅰ类致癌原；2015年，《全球幽门螺杆菌京都共识意见》再次强调根除H. pylori感染可以预防胃癌发生[2]。H. pylori主要定植于人类胃小凹中、部分游离存在于胃黏液层或粘附在胃黏膜细胞表面，通过Ⅳ型分泌系统将毒力因子注入胃黏膜细胞内，曾经被认为是一种胞外致病菌。但是，越来越多的研究提示H. pylori可以进入上皮细胞、吞噬细胞内存活，可能为兼性胞内菌[3～7]。然而，关于H. pylori是否与肠道细菌一样，如志贺氏杆菌、伤寒沙门氏菌等[8]，主要分布在细胞外和细胞表面，特定条件下进入细胞内引起持续性或复发性感染，目前尚不完全清楚。现就H. pylori的细胞内感染及相关机制研究进展综述如下。

1 人体胃黏膜组织中，细胞内H. pylori感染

H. pylori感染的人体胃黏膜活检组织，电镜下观察发现胃窦黏膜组织中的H. pylori主要分布在细胞连接处或粘附在细胞表面，但部分细胞内也可见到完整的H. pylori。Wyle等首先在透射电镜下观察到胃黏膜上皮细胞、壁细胞、主细胞内见到完整的H. pylori[9]。Bode和Ko等分别在肠化上皮细胞、基底细胞中也见到完成的H. pylori[10，11]。Noach等报道在电镜下观察到的231个H. pylori中，约71%的H. pylori游离存在于胃黏液中，约3%的H. pylori存在于上皮细胞内，其余的细菌粘附在细胞表面或部分被细胞膜包裹[12]；被细胞膜包裹的H. pylori可能进入细胞内。Ko和Chan等发现在胃黏膜活检标本，有2%～6%的标本中发现细胞内有完整的H. pylori存在[11，13]。另外，H. pylori还可存在于腺体的底部和壁细胞的微管中[14]。

电镜下观察到细胞内H. pylori感染可能与H. pylori的根除疗效有关。没有细胞内H. pylor感染的患者根除率明显高于胃黏膜底部有细菌感染或有细胞内细菌感染者[15]。尽管不同研究者均发现胃黏膜细胞内存在完整的H. pylori，但目前尚无证据表明人体组织中细胞内H. pylori是存活、复制的。

2 体外培养细胞中，细胞内H. pylori感染

在肠道细菌中，如志贺氏杆菌、伤寒沙门氏菌等，可以侵入肠黏膜上皮细胞内存活和繁殖，引起持续性或复发性感染[8]。大量研究观察了H. pylori是否与肠杆菌一样，可侵入细胞内存活并繁殖，结果发现在体外培养的上皮细胞、巨噬细胞、小鼠骨髓源性树突状细胞内双层膜结构的自噬小体中存在活的H. pylori。在巨噬细胞中，Wang等观察到H. pylori寄居于U937或THP-1细胞内双层膜样结构的自噬小体中，而且自噬小体的形成与H. pylori在细胞内的存活和复制密切相关，采用自噬激活剂雷帕霉素或抑制剂3-甲基腺嘌呤调控细胞自噬后，H. pylori在细胞内的复制水平受到影响[16]。Deen等采用免疫荧光共聚焦显微镜、投射电镜等观察到H. pylori被体外培养的THP-1、RAW264.7细胞吞噬进入细胞内，85%～95%的胞内细菌进入吞噬体内、小部分细菌游离在胞质中或存在于自噬体中[17]。在胃黏膜上皮来源细胞中，Amieva等采用微分干涉差光显微镜和免疫荧光显微镜在AGS细胞感染H. pylori后2～7小时均见到完整的细胞内细菌，采用H. pylori抗体染色证实为H. pylori；进一步动态观察细胞内H. pylori的运动轨迹，发现细胞内空泡中H. pylori可以从细胞内运动到细胞外[4]。

很多细菌对大环内酯类药物庆大霉素敏感，但庆大霉素不能渗透进入细胞内。因此，体外实验中庆大霉素常用来清除细胞外和细胞表面感染敏感细菌，但对细胞感染内细菌无效。在体外培养的上皮细胞(AGS、HEK293)，巨噬细胞(THP-1、U937)中采用庆大霉素清除细胞外感染及粘附的H. pylori后，将细胞裂解进行H. pylori培养，仍能检测到细胞内H. pylori生长[5，16，18]。H. pylori在细胞内可以存活72小时甚至更长时间[5，16，18]。体外培养的Hep-2细胞中球形变的H. pylori可以在胰蛋白酶消化传代培养几代后存活[19]。

3 细胞内H. pylori感染的机制

自噬异常是促进病原菌侵入细胞内存活、复制的的主要原因。在秀丽线虫中自噬相关基因失活会引起鼠伤寒沙门氏菌在细胞内的复制[20]；在小鼠中干扰细菌感染自噬相关途径将促进志贺氏杆菌在细胞内的复制[21]。自噬是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称，是真核细胞所特有的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制。

H. pylori感染也引起细胞自噬异常。H. pylori可能通过胞饮、酪氨酸激酶活化、肌动蛋白聚合、受体介导的胞吞作用侵入细胞内。人体胃黏膜组织中，细胞内H. pylori存在于空泡中，与自噬相关的溶酶体样结构相邻[10]。体外培养细胞中，Terebiznik等[19]首先报道H. pylori感染AGS细胞后可诱导细胞发生自噬，即在投射电镜下观察到自噬小体存在，自噬标记蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变，以及荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白标记的LC3(GFP-LC3)向自噬小体聚集。该过程依赖宿主的自噬蛋白Atg5 和Atg12，Atg5 和Atg12 敲除的细胞在感染H. pylori后，出现GFP-LC3 荧光斑点的数量减少和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变减少[19]。而且，在自噬缺陷的细胞模型中，细胞内H. pylori存活数量更多[22]。

进一步研究发现，细胞内H. pylori感染后，宿主细胞的自噬功能异常是H. pylori在细胞内存活的主要原因。H. pylori侵入细胞时，数十个与自噬囊泡形成、延展、成熟相关的分子表达异常，包括AKT1、MBRA1、APP、ATG16L1、ATG16L2、ATG3、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、BAD、BAX、BCL2L1、BECN1等表达降低，而CTSS、GABARAPL1、MAP1LC3B、NFKB1、SQSTM1、TNF的表达增加[23]。H. pylori感染后，微RNA30B表达上调导致其靶基因自噬相关蛋白Atg12和BECN1表达下降，诱导细胞发生自噬[18]。细菌脂多糖刺激细胞引起BECN1蛋白泛素化，使BECN1与BCL2解离从而诱导巨噬细胞发生自噬[24]，延迟吞噬后同型吞噬体融合[25]，阻止巨噬细胞内吞噬体的成熟[26]。H. pylori感染ATG16L1型宿主后，ATG16L1与NOD2受体相互作用募集自噬相关蛋白包绕入侵的细菌形成自噬小体、肽聚糖脱乙酰酶通过调节细胞NOD2受体通路，诱导产生的自噬小体中缺乏降解底物的组织蛋白酶D，使得功能缺陷的自噬小体不断蓄积，并成为H. pylori在细胞内存活和复制的庇护所(图1)[22]。H. pylori进入上皮细胞或巨噬细胞后可能出现三种结局:① 诱导细胞自噬，并在自噬体中被降解[5，16，19]；②下调自噬相关蛋白表达，逃逸自噬[17，18，22，25]；③ 利用自噬体为自身复制提供庇护所[4，5，7，16]。

图1 H. pylori感染后进入细胞内存活的可能机制[21]

体外研究显示vacA基因缺陷的突变型菌株及其无菌培养上清感染细胞后均不能形成自噬小体，提示VacA对H. pylori感染诱导的细胞自噬是必不可少的，而细菌的其他毒力因子如细胞毒素相关蛋白(CagA)、尿素酶，则无明显影响[21]。目前发现，影响H. pylori侵入细胞内存活的因素还包括体外培养细胞液中肽牛血清的浓度、宿主基因ATG16L1型等位基因突变可能促进H. pylori进入细胞[22]。

4 小结

H. pylori感染的患者和体外培养细胞中均发现H. pylori的细胞内感染，提示H. pylori可能为兼性胞内感染细菌。H. pylori在细胞内存活和复制可能是机体免疫反应和抗菌素无法将其彻底清除的原因之一，然而其确切机制仍不完全清楚。我国是H. pylori感染和胃癌的高发地区。尽管治疗H. pylori感染的方案越来越复杂，疗程也从7天延长到14天，即使是敏感抗菌素也可能出现治疗失败。细胞内感染可能在H. pylori感染所致的胃癌发生以及根除治疗失败中起重要作用，有待进一步深入研究。

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Advances in intracellular infection of helicobacter pylori

GAO Cai-ping，HAN Sheng-xi

国家自然科学基金青年项目(编号:81001083/H1617))

R573.6

B

1672-6170(2016)02-0171-03

2015-12-18；

2016-01-10)

△通讯作者