大鼠饮水奖赏条件反射的建立及其习得规律

张 鑫，吴广延，侯蓓蓓，刘文贤，余 茜

(1.四川医科大学，四川 泸州 646000；2.第三军医大学，重庆 400038；3.四川省医学科学院·四川省人民医院康复科，四川 成都 610072)

大鼠饮水奖赏条件反射的建立及其习得规律

张 鑫1，吴广延2，侯蓓蓓1，刘文贤1，余 茜3

(1.四川医科大学，四川 泸州 646000；2.第三军医大学，重庆 400038；3.四川省医学科学院·四川省人民医院康复科，四川 成都 610072)

目的 以自由活动的大鼠作为实验动物建立饮水奖赏条件反射，分析其建立和消退特征。方法 20只成年雄性大鼠，分为配对组和非配对组各10只，配对组给予以声音作为条件刺激，固定的间隔时间后给予水滴作为奖赏性非条件刺激进行饮水条件反射训练，非配对组同样以声音作为条件刺激，但给予一个随机的时间间隔后的水滴作为非条件反射进行训练，利用红外发射及接收装置探查大鼠的饮水反应，通过生理记录仪记录相关行为，比较两组饮水反应习得率和潜伏期。结果 配对组大鼠能够习得饮水奖赏条件反射，7天训练后习得率维持在60%以上的高水平；反应潜伏期随训练时间增加而缩短；消退实验中大鼠的习得率迅速下降并维持在10%以下的低水平。非配对组不能习得饮水奖赏条件反射，习得率维持在20%以内的低水平。结论 自由活动的大鼠能建立奖赏饮水条件反射，习得后也能迅速消退。

饮水反射；大鼠；习得率；潜伏期

学习记忆是中枢神经系统的一项重要的高级生命活动，作为一种最简单的学习记忆行为，经典条件反射包括恐惧性条件反射、眨眼条件反射等已被广泛地应用于学习记忆研究中，并且极大的推动了我们对学习记忆神经机制的了解。相关研究表明，不同的条件反射类型涉及到的神经机制并不一致，其中经典条件反射的中枢主要涉及皮质下结构，例如恐惧性条件反射属于情绪性学习，其中枢位于杏仁核，而眨眼条件反射属于运动性学习，其中枢位于小脑。而奖赏性条件反射行为需要觉察功能的参与，涉及更为复杂的神经机制，相关领域目前对其了解甚少。饮水条件反射是一种涉及奖赏行为的条件反射，Petr等应用饮水条件反射模型研究听觉皮层和丘脑对声音刺激行为的调节[1]，Heath等应用该行为研究了大脑皮层对学习认知功能的调控[2]，但类似研究采用固定动物进行训练，且国内相关领域尚未有应用该模型的研究报道。本研究通过配对呈现条件刺激(CS)与奖赏性非条件刺激(US)，成功建立了大鼠饮水奖赏条件反射，为我们后续研究条件反射的神经机制提供了有效模型，现将大鼠饮水奖赏条件反射训练装置和训练结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年SD大鼠20只，雄性，体重约250～300 g，听力灵敏、嗅觉正常，无明显耳鼻疾病，由第三军医大学动物中心提供。实验动物实行单笼饲养，饮食自由，饲养温度在25 ℃左右，保持环境干燥通风。该实验于每日9：00～15：00进行。大鼠按照随机数字表分为配对组和假配对组各10只，两组月龄、体重等差异无统计学意义。

图1 饮水自动训练装置和训练模式示意图 a：大鼠在密闭隔音暗箱内接受饮水奖赏条件反射行为训练的模式图。b：刺激间隔为1500 ms饮水奖赏条件反射行为训练模式的CS、US的记录曲线。c：红外发射及接收装置模式图

1.2 方法 所有大鼠于实验开始前48小时进行限制饮水，即仅于每日16：00时给予5分钟的自由饮水，以保持基本饮水需求并制造次日训练过程的饥渴感，直至实验结束。饮水条件反射训练前3日，每天将大鼠放入训练箱内自由活动1小时，不给予任何CS及US，以适应训练环境。条件训练在密闭隔音暗箱(30 cm×43 cm×35 cm)中进行，环境声级为45 dB左右，以2000 Hz、90 dB、500 ms的纯音作为CS，以饮水条件反射自动训练装置瞬时性给予的水滴作为US，每次约20 μl。通过本实验室研发的红外发射及接收装置探察大鼠饮水舌尖对发光二极管光路的阻断效应，通过接收二极管将该效应转换为电信号，作为大鼠的饮水反应活动(图1a)。通过RM6240生理记录仪(图1b)对该信号进行记录，并同步记录每次训练过程中的声音和水滴标记。

配对组的训练分为适应期3天、配对期10天和消退期5天；假配对组则为适应期3天、假配对试验10天和消退期5天。训练次数均为100次/天。适应训练是指仅给予CS而不给予US的训练模式，旨在尽量减小因CS而引起的惊吓反应，避免影响实验结果及数据的准确性。假配对训练是指系统通过随机的方式呈现CS和US，二者间的呈现间隔2～10 s变化，目的在于使CS与US之间的关联性降到最小。配对训练是指在CS结束后1500 ms呈现一个固定的US，每次配对训练间隔40～50 s(图1c)；在消退期，仅给予大鼠CS而并不给予任何US。在CS结束后1500 ms内，大鼠在听见声音后做出饮水动作称为一次条件性饮水反应，大鼠的饮水习得率(CR%)=一天训练总条件性饮水反应次数/100×100%，饮水潜伏期为CS起点与条件性饮水反应开始时刻之间的时间间隔。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所有数据用均数±标准差表示，采用重复测量双因素方差分析、拆分单因素方差分析，以及LSD posthoct检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 条件化饮水反射训练中的参数变化 配对组大鼠可以习得条件化饮水反射，其CR%高于假配对组，潜伏期低于假配配对组，差异有统计学意义(P < 0.05)。配对组训练期第一天CR%为(5.3±4.97)%，且随训练天数的增加而增加，第七天为(60.7±11.15)%，明显高于第一天(P< 0.05)，之后维持在60%以上高水平。配对组第一天潜伏期为(1094.73±605.1)ms，且随训练时间的增加而下降，于第七天下降至(479.63±275.92)ms，明显低于第一天，后维持在400 ms以下。而在假配对组，大鼠未能习得条件化饮水反射，且习得率始终保持在较低水平(< 30%)。

图2 两组大鼠训练期条件化饮水的参数变化 a：CR%；b：潜伏期

2.2 消退期参数变化 消退期中，配对组大鼠的CR%和潜伏期有明显的时间效应。第一天CR%为(61.2±9.704)%，并随消退训练时间增加而逐步递减，至第3天为(9.9±3.84)%，明显低于第一天，并维持在10%以内低水平；第一天潜伏期为(323.39±144.05)ms，并随训练时间的增加而增长，至第三天为(907.87±265.39)ms，并始终维持在1000 ms以上的高水平。非配对组大鼠的CR%和潜伏期无明显的时间效应(P> 0.05)。见图3。

图3 两组消退期CR%随训练时间的变化

3 讨论

作为经典式条件反射行为，眨眼条件反射、恐惧条件反射都是常用的联合型学习记忆模型，联合学习指个体对不同时间发生的事件进行联系并从行为上表达出来。眨眼反射是一种联合性运动学习，其基本神经环路集中在脑干和小脑环路[3～5]，并且具有同侧小脑依赖性[6]，但是眨眼反射行为模型容易受到自发眨眼和惊吓眨眼的干扰，影响结果的准确性。恐惧性条件反射属于情绪性学习，分为线索式和场景式两类，但其中枢都位于杏仁核[7～9]。作为操作式条件反射行为，条件化饮水反射的建立在国外已有报道，它作为一种实用的复合联想型学习行为模型在神经科学领域广泛应用，但多是利用固定动物进行训练[2]，对于采用自由活动动物建立条件化饮水反射及其行为习得规律未见具体研究报道。

本文结果提示自由活动大鼠在配对给予CS与US的第七日可习得条件化饮水反射，但在CS与US间隔时间随机的假配对实验中自由活动大鼠却无法习得该行为，提示配对组大鼠的饮水反应是一种联合性学习。Santiago Jaramillo以固定的大鼠训练其饮水条件反射，发现在声音频率为14 kHz时，其CR%为50%，在声音频率为31 kHz时，其CR%为84%[10]，提示高频率声音有利于大鼠饮水反射的习得，在本研究中采用的声音频率为2000 Hz，大鼠CR%最高可达67.4%，且平均维持在60%左右，可见条件化饮水反射的习得过程对于CS的需求有很宽的频阈。本研究中CR%低于文献报道的80%～90%，除了CS频率较低的原因之外，也有可能与自由活动的大鼠在听到声音CS后，有时没有足够时间到达给水口有关，因CS-US有效总间隔仅为2000 ms，实验中，我们发现大鼠有时接触到给水口已经在US呈现后。因此，适当延长CS-US应该可以提高CR%，另外Teresa E以小鼠为实验动物建立饮水条件反射研究研究吞咽功能，其CR%可达80%[11]，与本实验结果接近。

大鼠条件化饮水反射行为的习得非常迅速，在第七天的训练后基本可达到60%以上水平，潜伏期也降至500 ms内，而且消退也同样迅速，在第三天迅速降至10%以内，与眨眼条件反射习得和消退所需的时间相似，但是明显长于恐惧性条件反射。对于不同的联合性学习类型的习得和消退所需的时间差异及其神经机制是值得深入探讨的问题。

就技术细节而言，该模型建立的主要难点在于奖赏性US的量的控制。当水量过小时，动物对CS与US的敏感性降低，有时对二者产生不易产生联系；当水量过大时，动物有时会出现非触发式饮水，即不通过给水喷头获取饮用水，转而利用水滴直接滴落在口腔的“接饮”式饮水。不管是水量过小还是过大，都将影响到行为训练的进展和实验数据的准确性，所以如何将水流量控制在最佳水平是该模型成功的关键。

条件化饮水奖赏反射行为涉及复杂的神经机制，该模型的建立为探讨操作式条件反射以及复杂学习记忆行为的中枢机制打下了基础。由于该行为涉及高级觉察功能，未来应针对前额叶、海马等脑区对于该行为的影响及其中枢通路机制进行深入研究。

[1] Petr Z，Zador AM.Corticostriatal neurons in auditory cortex drive decisions during auditory discrimination[J].Nature，2013，497(7450)：482-485.

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[11]Teresa E，Lever Ryan T，Brooks Lori A.Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia[J].Dysphagia，2015，30：328-342.

The establishment of rat’s drinking water reward conditioned reflex and its acquisition characteristics

ZHANG Xin1，WU Guang-yan2，HOU Bei-bei1，LIU Wen-xian1，YU Qian3

(1.Sichuan Medical University，Luzhou 646000，China；2.Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；3.Rehabilitation Department，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

YUQian

Objective To establish the drinking water reward conditioned reflex on freely moving rats for analyzing its establishment and fading characteristics.Methods Twenty adult male rats were divided into paired group and non-paired group，10 in each group.The paired group was treated with voice as conditioned stimulus and given the water droplets as reward unconditioned stimulus in a fixed time interval.The non-paired group was also treated with voice as conditioned stimulus and given the water droplets as reward unconditioned stimulus in a random time interval.Their drinking reaction was detected through an infrared transmitter and receiver.The acquisition and incubation period of drinking reaction was surveyed by using multi-channel recorder.The acquisition rate and incubation time were compared between the two groups.Results Acquisition of conditioned reflex during drinking reward was founded in the paired group and maintained a high level with more than 60% acquisition rate after 7 days training.With increasing of training time，the response latency period was reduced.In fade test，acquisition rate dropped rapidly and keep a low level under 10%.Acquisition of conditioned reflex during drinking reward was not founded in the non-paired group and maintained a low level of within 20% acquisition rate.Conclusion The drinking water reward conditioned reflex can be built on freely moving rats and it will disappear after they complete the acquisition.

Drinking water reflection； Rat； Acquisition rate； Incubation

四川省科技厅科研基金资助项目(编号：2014JY0032)

余 茜

R338.61

A

1672-6170(2016)02-0057-04

2015-12-24；

2016-01-08)