SYBR GREEN荧光定量聚合酶链反应检测粘蛋白1在乳腺癌诊断中的应用

孙昌瑞，邓 君，冯 林，洪 华，江咏梅

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.四川省妇幼保健医院检验科，四川 成都 610071；3.四川大学华西第二医院检验科，四川 成都 610041)

SYBR GREEN荧光定量聚合酶链反应检测粘蛋白1在乳腺癌诊断中的应用

孙昌瑞1，邓 君1，冯 林2，洪 华1，江咏梅3

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072；2.四川省妇幼保健医院检验科，四川 成都 610071；3.四川大学华西第二医院检验科，四川 成都 610041)

目的 探讨SYBR GREEN荧光定量聚合酶链反应法检测外周血循环肿瘤细胞中粘蛋白1基因表达水平在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法 以β-actin为内对照，采用SYBR GREEN荧光定量聚合酶链反应法测定45名健康女性体检者、91例良性乳腺疾病患者和193例乳腺癌患者以及87例其它肿瘤患者外周血中粘蛋白1的表达量，分析不同临床病理因素与基因表达的相关性。结果 乳腺癌患者粘蛋白1阳性率显著高于健康体检者、良性乳腺疾病和其它肿瘤患者(P< 0.05)；良性乳腺疾病及其它肿瘤患者粘蛋白1阳性率显著高于健康体检者(P< 0.05)，而良性乳腺疾病与其它肿瘤患者粘蛋白1阳性率差异无统计学意义(P> 0.05)； 乳腺癌临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移及HER2/neu表达是MUC1 mRNA表达独立相关因素(P< 0.05)。结论 SYBR GREEN 荧光定量聚合酶链反应法是灵敏较高、特异较强的快速定量检测粘蛋白1方法，可有效监测乳腺癌诊断、疗效、转移和预后。

SYBR GREEN；荧光定量聚合酶链反应；粘蛋白1；乳腺癌

2011年1月至2014年6月四川省人民医院采用SYBR GREEN 实时荧光定量PCR检测45例健康女性体检者、91例良性乳腺疾病患者、193例乳腺癌患者和87例其它肿瘤患者外周血中粘蛋白1(human mammaglobin，MUC1)基因的表达量，探讨其对乳腺癌诊断和疗效监测的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年1月至2014年6月来自四川省人民医院门诊和住院部的91例良性乳腺疾病患者(年龄28～77岁)、193例乳腺癌患者(年龄31～78岁)以及87例其它肿瘤患者(年龄32～81岁)，均经病理学确诊。91例良性乳腺疾病患者中53例为纤维瘤，38例为脂肪瘤，排除患其它肿瘤的可能性。87例其它肿瘤患者中结肠癌31例、肺癌26例，卵巢癌30例。良性乳腺疾病患者、乳腺癌和其它肿瘤患者均于手术前1周内取晨血5 ml。对照组为同期健康女性体检者45名(年龄27～75岁)。

1.2 试剂和仪器 逆转录反应体系、FQ-PCR反应体系和β-actin内对照试剂盒均来自美国ABI生物公司，7700 Sequence Detector 分析仪为美国ABI生物公司生产，cDNA标准品由上海申友公司合成。

1.3 FQ-PCR引物和探针 采用PE公司Primer Express软件设计MUC1的引物和探针，引物和探针序列：MUC1 正义引物正向，5′-3′CGTCGTGGACATTGATGGTACC，MUC1反义引物，5′-3′ GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA，β-actin引物：正向，5′-3′ctcttccagccttccttcct，反向，5′-3′ agcactgtgttggcgtacag，由上海基康生物公司合成。

1.4 FQ-PCR反应 ①取静脉血5 ml，弃去开始的1 ml，以防上皮细胞的污染，1 mg/ ml EDTA抗凝，生理盐水稀释2～3倍，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA。②cDNA合成：逆转录反应体系20 μl，包括细胞总RNA 1 μg，随机引物200 ng，RNasin 20 U，5×逆转录反应缓冲液4 μl，M-MLV反转录酶20U。42 ℃反应55 min。③PCR：反应体系逆转录产物5 μl，寡聚核苷酸引物各为400 nmol/L，探针150 nmol/L，dATP 、dCTP和dGTP各200 μmol/L，dUTP 400 μmol/L，10×缓冲液5 μl，MgCl25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5U。在7700 Sequence Detector 分析仪上测定标准品和标本MUC1和β-actin含量。扩增参数为：50 ℃2 min，95 ℃10 min；再94 ℃30 s，66 ℃1 min，40个循环，采用ABIfast 7500荧光分析仪进行测定。根据标准曲线，仪器自动计算出标本中MUC1和β-actin的拷贝数/ml，以MUC1和β-actin比值作为MUC1的表达水平。

1.5 阳性判断 应用 2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量(Ct 为循环阈值)。ΔCt 值=目的基因(MUC1)Ct 值-β-actin 基因 Ct 值，以 β-actin 为对照；ΔΔCt =乳腺癌组的 ΔCt 值-健康体检组的 ΔCt 值，以健康体检组为对照。30例健康人的基因表达相对量为 1.003±0.087，2-ΔΔCt值为乳腺癌组基因相对健康体检组基因表达的倍数，测定值以2-ΔΔCt>2 为表达阳性。阳性率=阳性表达人数/总人数×100%。

1.6 统计学方法 应用SPSS 17.0 软件进行数据分析。MUCl阳性率的比较采用卡方检验。采用多因素logistic回归分析检验MUC1癌基因表达与乳腺癌临床病理因素的关系。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康体检者、良性乳腺疾病、其它肿瘤患者和乳腺癌患者MUC1阳性率比较 乳腺癌患者MUC1阳性率显著高于健康体检者、良性乳腺疾病和其它肿瘤患者(χ2分别为5.03，4.78，3.79，均P< 0.05)；良性乳腺疾病和其它肿瘤患者MUC1阳性率显著高于健康体检者(χ2分别为4.02，4.23，均P< 0.05)，而良性乳腺疾病和其它肿瘤患者MUC1阳性率差异无统计学意义(χ2=0.56，P> 0.05)，见表1。

表1 健康女性和乳腺疾病患者MUC1阳性率

2.2 MUC1癌基因表达与乳腺癌临床病理因素的关系 以患者年龄、大小、类型和雌激素受体ER、孕激素受体PR的表达水平、乳腺癌临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移和HER2/neu表达为自变量，以是否有MUC1 mRNA表达为因变量进行多元回归分析，结果发现，乳腺癌临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移和HER2/neu表达是MUC1 mRNA表达独立相关因素(P< 0.05)；患者年龄、大小、类型和雌激素受体ER、孕激素受体PR的表达水平不是MUC1 mRNA表达独立相关因素 (P> 0.05)，见表2。

表2 乳腺癌患者MUC1 mRNA表达阳性多因素回归分析

3 讨论

粘蛋白(MUC)是广泛分布于机体正常黏膜表面的高分子量糖蛋白，迄今发现有13种(MUC1～MUC13)[1]。MUC1基因定位于染色体1q21，cDNA长1821bp，具有基因多态性。MUC1基因是通过筛选从乳腺癌、胰腺癌等细胞系构建的cDNA表达文库克隆而得到的。MUC1基因的编码产物MUC1粘蛋白是一种具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其分子由肽核心和糖链组成。由于MUC1基因被成功克隆，发现MUC1在正常人体主要存在于胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及乳腺等多种上皮组织中，除有对正常的上皮起润滑和保护作用，还有介导信号转导和细胞粘附功能，免疫活化和抑制作用等[2]。而在乳腺肿瘤组织中MUC1多出现量和质的异常表达。因此，MUC1可能成为一种新的肿瘤标志物，用于乳腺癌的诊断、治疗和预后判断。

近年来，采用PCR方法检测MUC1 mRNA表达有一些相关报道，Strati等发现，采用FQ-PCR检测51例确诊的转移性乳腺癌的外周血，MUC1基因表达阳性率为45.1%[3]。Mana等报道，采用RT-PCR检测60例乳腺癌患者外周血，MUC1 mRNA的表达阳性率为90.0%[4]。Cheng等报道，采用RT-PCR检测34例转移性乳腺癌外周血，MUC1 mRNA化疗前后的阳性率分别为88.2%和70.6%[5]。

FQ-PCR是目前采用得较多的研究乳腺癌基因表达的分子学方法[6，7]，本试验用FQ-PCR检测了45名健康女性体检者、91例良性乳腺疾病患者、87例其它肿瘤患者和193例乳腺癌患者的外周血中MUC1的基因表达，并以β-actin作为内对照，结果发现乳腺癌患者MUC1阳性率显著高于健康体检者、良性乳腺疾病和其它肿瘤患者，良性乳腺疾病和其它肿瘤患者MUC1阳性率显著高于健康体检者，良性乳腺疾病和其它肿瘤患者MUC1阳性率差异无统计学意义。

在与病理学特性的比较中，以患者年龄、大小、类型和雌激素受体ER、孕激素受体PR的表达水平、乳腺癌临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移和HER2/neu表达为自变量，以是否有MUC1 mRNA表达为因变量进行多元回归分析，结果发现，乳腺癌临床分期、组织学分级、腋淋巴结转移和HER2/neu表达是MUC1 mRNA表达独立相关因素；患者年龄、大小、类型和雌激素受体ER、孕激素受体PR的表达水平不是MUC1 mRNA表达独立相关因素。

综上所述，FQ-PCR法能快速定量检测外周血中MUC1的基因表达，具有高灵敏度、高特异性、高精确性、高效率和污染小等特点，而且标本来源容易，对于乳腺癌的诊断、治疗和转移提供更为可靠客观的根据，是一种值得推荐的实验室诊断方法。

[1] Williams SJ，Wreschner DH，Tran M，et al.MUC13：a novel humancell surface mucin expressed by epithelial and hemopoietic cell [J].J Biol Chem，2001，276(21)：18327-18336.

[2] Gendler SJ.MUC1，the renaissance molecule [J].J MammaryGland Biol Neoplasia，2001，6 (3)：339-353.

[3] Strati A，Parrella P，Copetti M，et al.Comparison between real-time quantitative PCR detection of HER2 mRNA copy number in peripheral blood and ELISA of serum HER2 protein for determining HER2 status in breast cancer patients[J].Cell Oncol，2009，31(3)：203-211.

[4] Mana O，Sacid B，Mohammad AM，et al.Molecular markers in peripheral blood of Iranian women with breast cancer[J].Cancer Microenviron，2012，6：109-116.

[5] Cheng JP，Yan Y，Wang XY，et al.MUC1-positive circulating tumor cells and MUC1 protein predict chemotherapeutic efficacy in the treatment of metastatic breast cancer[J].Chinese Journal of Cancer，2011，30(1)：54-61.

[6] 孙昌瑞，冯林，邓君，等.联合检测乳腺癌易感基因1与Ccnd1 mRNA在乳腺癌诊断中的应用研究[J].实用医院临床杂志，2014，11(6)：67-69.

[7] 邓君.细胞角蛋白19 联合B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因mRNA 检测诊断乳腺癌的临床研究[J].实用医院临床杂志，2013，10(1)：70-72.

The application of SYBR GREEN fluorescent quantification polymerase chain reaction for the detection of human mammaglobin mRNA in the diagnosis of breast cancer

SUN Chang-rui1，DENG Jun1，FENG Lin2，HONG Hua1，JIANG Yong-mei3

(1.Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Hospital of Sichuan Province，Chengdu 610071，China；3.Clinical Laboratory，West China Second University Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

DENGJun

Objective To investigate the application of SYBR GREEN fluorescent quantification polymerase chain reaction (SYBR GREEN FQ-PCR)to detect the MUC1 mRNA of circulating tumor cells in diagnosis and therapeutic monitoring of breast cancer.Methods With β-actin as internal control，MUC1 mRNA in peripheral blood cell samples in 45 health women，91 patients with benign breast disease and 193 patients with breast cancer and 87 with other cancer patients were detected by SYBR GREEN FQ-PCR.The relationship between MUC1 mRNA and clinicopathological parameters was analyzed.Results The positive rate of MUC1 mRNA detection in the patients with breast cancer was significantly higher than that in healthy individuals，patients with benign breast disease patients and other types of cancers (P< 0.05).The positive rate in the patients with benign breast disease and other types of cancers was significantly higher than that in the healthy individuals (P< 0.05).There was no significant difference in the positive rate between benign breast disease patients and other cancer patients (P>0.05).The independent factors of MUC1 mRNA expression were clinical stage，histological grade and axillary metastatic lymph node and HER2/neu (P<0.05).Conclusion FQ-PCR is a rapid and sensitive and specific method for quantitative detection of mucin1 mRNA.It can be used for the diagnosis，therapy，metastasis and prognosis of breast cancer.

SYBR Green；Polymerase chain reaction；Mucin1；Breast cancer

四川省杰出青年基金资助项目(编号：2007-5-345)；四川省卫生厅科研基金资助项目(编号：120112)

邓 君

R446.62

A

1672-6170(2016)02-0054-03

2015-09-16；

2015-12-10)