万古霉素非敏感肠球菌的筛选和基因型分析

孙琅，刘建华，聂彤颖，胡辛欣，李聪然，游雪甫



万古霉素非敏感肠球菌的筛选和基因型分析

孙琅，刘建华，聂彤颖，胡辛欣，李聪然，游雪甫

【摘要】

目的对实验室保存的 325 株肠球菌进行万古霉素非敏感肠球菌筛选，并对筛选出的菌株进行耐药表型、耐药基因型、菌株同源性分析。

方法采用琼脂平皿二倍稀释法筛选万古霉素非敏感肠球菌，并检测菌株对替考拉宁的敏感性；采用 PCR 方法检测万古霉素非敏感肠球菌的耐药基因型；通过肠道细菌基因间重复一致序列（ERIC）PCR 技术、脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术、多位点序列分型（MLST）技术进行菌株的同源性分析。

结果从 325 株临床分离肠球菌中共筛选出 17 株万古霉素非敏感肠球菌，包括 1 株粪肠球菌、11 株屎肠球菌和5 株鹑鸡肠球菌。其中 1 株粪肠球菌和 11 株屎肠球菌对万古霉素显示高水平耐药，对替考拉宁耐药或中介耐药，PCR 检测结果显示 vanA 型；5 株鹑鸡肠球菌对万古霉素中介耐药，对替考拉宁敏感，PCR 检测结果显示 vanC1 型。ERIC 同源性分析显示同基因型的大多数菌株显示相似的分型；PFGE 同源性分析显示，17 株临床万古霉素非敏感肠球菌分型不同，不属于单克隆流行播散；MLST 同源性分析显示，1 株临床万古霉素非敏感粪肠球菌属于 ST4，11 株临床万古霉素非敏感屎肠球菌共分为 6 个 ST 型，其中 4 株属于 ST78，是屎肠球菌出现频率最高的 ST 型。

结论我国万古霉素耐药菌在粪肠球菌中分离率较低，但屎肠球菌中万古霉素耐药情况较严重，并且耐药菌株携带易于传播和转移的 vanA 基因。同源性分析结果显示万古霉素耐药存在同源性传播的可能性。

【关键词】粪肠球菌；屎肠球菌；万古霉素抗药性；基因型；多位点测序分型；肠道细菌基因间重复一致序列

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(3):206-215

作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所药理室（孙琅、聂彤颖、胡辛欣、李聪然、游雪甫）；075000 张家口，河北北方学院附属第一医院呼吸内科（刘建华）

肠球菌是一种较常见的革兰阳性条件致病球菌，可导致人体多脏器感染，其中粪肠球菌和屎肠球菌是导致人体感染的常见肠球菌，而其他类型肠球菌如铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌等也时有致病情况出现。万古霉素为糖肽类抗生素，被用作“最后一道防线”治疗对其他抗生素无效的严重革兰阳性菌感染，如严重肠球菌感染。而万古霉素耐药肠球菌（vancomycin resistant enterococci，VRE）的出现对临床治疗带来了极大的困难。1988 年，英国伦敦首次报道 VRE［1-2］，此后在多个国家都分离出VRE 菌株，并且 VRE 分离率出现明显上升趋势。美国 VRE 感染率 1989 年为 0.4%，而 2005 年则上升到 28% 左右［3］，2013 年 VRE 院内感染率达到了 30%。美国每年约有 20 000 人感染 VRE，约 1300 人死亡［4］。在欧洲，由于阿伏帕星早期在畜牧业的广泛应用，导致动物肠道 VRE 菌株大量存在［5］。我国 VRE 发生率相对较低，一直稳定在3% ～ 5% 之间，但近年来屎肠球菌在整个肠球菌中所占的比例在上升，而 VRE 主要出现在屎肠球菌中。CHINET 细菌耐药监测网数据结果显示，万古霉素耐药屎肠球菌分离率 2005 年为 0.35%［6］，而2014 年上升至 4.2%［7］。

目前还没有有效治疗 VRE 感染的药物，临床上主要通过 VRE 耐药表型来选择治疗药物。根据菌株对万古霉素和替考拉宁的不同耐药水平及耐药基因簇的差异，可将 VRE 分为 9 种表型，vanA、vanB、vanC（C1、C2、C3）、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM 和 vanN［8-12］。其中 vanA、vanB、vanD 和 vanM 型介导合成以 D-丙氨酸-D-乳酸结尾的肽聚糖前体，而 vanC、vanE、vanG、vanL 和vanN 型介导合成以 D-丙氨酸-D-丝氨酸结尾的肽聚糖前体，两种前体对糖肽类亲和力降低（与天然的以 D-丙氨酸-D-丙氨酸结尾的前体相比），从而表现出对糖肽类的耐药性。vanA 型和 vanB 型是具有重要临床意义的耐药表型，两者耐药菌株多见于屎肠球菌和粪肠球菌。vanA 型耐药的 VRE 对万古霉素呈现高水平耐药（MIC 64 ～ ＞ 512 μg/ml），可以由万古霉素和替考拉宁诱导产生，多由质粒介导，耐药基因位于转座子 Tn1546 上，易于转移。vanB 耐药表型对万古霉素呈现异质性的耐药，而对替考拉宁表现为敏感。vanB 型耐药基因多位于宿主染色体上，也可存在于质粒上，耐药性也可被转移。vanC 耐药多见于低水平万古霉素耐药（MIC 4 ～ 32 μg/ml）的天然菌株，如铅黄肠球菌或鹑鸡肠球菌等，并且对替考拉宁敏感。本研究中，我们对实验室保存的 2006 - 2012 年临床分离的 325 株肠球菌进行了万古霉素耐药性的筛选，并对筛选出的 VRE 进行了耐药基因型分析，以期为应对VRE 感染和抗 VRE 药物研发提供支持和参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株实验菌株为 2006 - 2012 年从北京地区医院患者尿液、痰液、血液、分泌物等标本中分离的 325 株肠球菌，包括 208 株粪肠球菌，111 株屎肠球菌和 6 株其他肠球菌（铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌）。质控菌粪肠球菌 ATCC29212、粪肠球菌 ATCC51299（vanB）、粪肠球菌 ATCC700802、粪肠球菌 ATCC51575、屎肠球菌 ATCC700221 （vanA）购自美国模式培养物中心（ATCC），菌株经 VITEK 2-compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定后使用。对于筛选出的万古霉素非敏感菌株用 16S rRNA 测序法再次确定菌株类型。

1.1.2试剂万古霉素、替考拉宁为中国食品药品检定研究院标准品；BHI 琼脂为美国 BD 公司产品；GoTaq Green MasterMix 为美国 Promega 公司产品；溶菌酶为上海生工生物工程有限公司产品；变溶菌素为美国 Sigma 公司产品；蛋白酶 K、限制性内切酶 Sma I 为日本 Takara 公司产品；MidRange PFG marker I 为美国 BioLabs 公司产品；PCR 引物的合成和产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.1.3主要仪器PCR 扩增仪为美国 AB 公司产品；全自动微生物分析鉴定仪为法国 Bio-Merieux公司产品；凝胶成像仪和脉冲场凝胶电泳仪为美国Bio-Rad 公司产品。

1.2方法

1.2.1万古霉素非敏感肠球菌筛选通过琼脂平皿二倍稀释法测定受试肠球菌对万古霉素的敏感性（最小抑菌浓度），筛选万古霉素非敏感肠球菌。所用培养基为含 5% 无菌羊血的 MH 琼脂。实验过程中将过夜培养的新鲜菌液适当稀释后，接种于含不同万古霉素浓度的血平皿中，使接种量为104CFU/点，37 ℃ 培养 24 h，肉眼观察无菌生长的最低药物浓度即为最小抑菌浓度。万古霉素受试浓度为 0.03 ～ 128 μg/ml。以万古霉素敏感菌粪肠球菌ATCC29212 和万古霉素耐药粪肠球菌ATCC51299 为质控菌。肠球菌的万古霉素敏感性标准为：≤ 4 μg/ml，敏感；8 ～ 16 μg/ml，中介；≥32 μg/ml，耐药［13］。

1.2.2万古霉素非敏感肠球菌的耐药表型测定对筛选出的万古霉素非敏感肠球菌，测定其对替考拉宁的敏感性，根据菌株对万古霉素和替考拉宁的 MIC 值获得其耐药表型特征。菌株对替考拉宁的最小抑菌浓度测定方法同万古霉素，替考拉宁受试浓度范围为 0.03 ～ 128 μg/ml。肠球菌的替考拉宁敏感性标准为：≤ 8 μg/ml，敏感；16 μg/ml，中介；≥ 32 μg/ml，耐药［13］。

1.2.3万古霉素非敏感肠球菌耐药基因的 PCR检测对筛选出的万古霉素非敏感肠球菌，用 PCR方法检测万古霉素耐药基因 vanA、vanB、vanC1、vanC2/3。参考文献［14］设计引物，所用引物及扩增片段大小见表1。水煮法提取染色体 DNA 制备PCR 模板，方法为取划线于 BHI 琼脂平皿上的新鲜菌落 3 ～ 5 个，悬于 50 μl ddH2O 中，煮沸 10 ～15 min；离心取上清。PCR 反应条件为 95 ℃ 预变性 3 min；95 ℃ 变性 30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，重复 35 个循环，而后再 72 ℃ 延伸5 min。PCR 结束后用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，并取不同基因型阳性菌株条带测序鉴定。实验过程中不含耐药基因的万古霉素敏感菌粪肠球菌ATCC29212 为阴性质控，而含耐药基因 vanA 或vanB 的粪肠球菌 ATCC51299（vanB）、粪肠球菌ATCC700802（vanB）、粪肠球菌 ATCC51575 （vanB）、屎肠球菌 ATCC700221（vanA）为阳性质控。每个菌株至少重复 2 次实验。

1.2.4ERIC-PCR 技术进行菌株的同源性分析用 ERIC-PCR 分析［15］实验菌株的同源性。所用引物为 ERIC-P，序列见表1。菌株总 DNA 提取方法如前所述。ERIC-PCR 体系为 20 μl，引物终浓度为 0.25 μmol/L。PCR 反应条件为 95 ℃ 预变性 7 min；94 ℃ 变性 1 min，36 ℃ 退火 1 min，65 ℃ 延伸 8 min，重复 32 个循环；而后再 65 ℃延伸 16 min。PCR 结束后用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，根据菌株 ERIC-PCR 条带特点分型，主、副带均相同判定为同一型；主带相同、副带不同判定为同一型的不同亚型；主带不同判定为不同型。

1.2.5PFGE 技术进行菌株的同源性分析对筛选得到的临床非敏感肠球菌，采用 PFGE 分析菌株同源性［16］。挑取单个菌落于 4 ml 脑心汤液体培养基中，37 ℃ 静止培养过夜至 OD610 nm为 1.3 ～ 1.4，取 300 μl 菌液离心取沉淀（12 000 r/min、2 min）。用 150 μl CSB 缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，pH 8.0）重悬菌体沉淀，加入3 μl 浓度为 100 mg/ml 的溶菌酶和 3 μl 浓度为1 kU/ml 变溶菌素于 37 ℃ 孵育 5 min，向菌体中加入 150 μl 1% 低熔点琼脂糖灌注模型。模块凝固后置于加入 35 μl 溶菌酶和 10 μl 变溶菌素的500 μl TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中孵育 4 h，弃去裂解液，用 TE 缓冲液洗涤 2 遍，加入 1 ml CLB（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，pH 8.0，加 1% 十二烷基肌氨酸钠）缓冲液和 40 μl 浓度为 20 mg/ml的蛋白酶 K，于 54 ℃ 条件下消化过夜。用 1 ml水洗 2 次，再用 TE 洗 3 遍，在第 1、2 次洗涤时加入 1 mmol/L PMSF 使残余的蛋白酶 K 失活。用刀片切下约 2 mm 的胶，加入 40 U 限制性内切酶 Sma I 于 37 ℃ 下酶切 2 h，上样跑胶。粪肠球菌、屎肠球菌电泳程序为电压：6 V，脉冲时间：1 ～ 20 s，电泳时间：20 h。鹑鸡肠球菌电泳程序为电压：6 V，脉冲时间：1 ～ 15 s，电泳时间：20 h。采用 Quantity One 软件绘制菌株进化树。

表1　万古霉素耐药基因 PCR 检测及 ERIC 分型所用引物Table 1　Primers used in PCR detection of the vancomycin resistance gene and ERIC typing

表2　屎肠球菌 MLST 分型 7 个等位基因所用引物Table 2　Primers used in MLST of Enterococcus faecium

1.2.6MLST 技术进行菌株的同源性分析扩增7 个内源性管家基因，反应条件及引物序列参考MLST 网站（http：//www.mlst.net/），屎肠球菌扩增基因分别是 adk、atpA、ddl、purK、pstS、gyd、gdh，引物序列见表2，粪肠球菌扩增基因分别是gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiqL，引物序列见表3，所有 PCR 产物进行双向测序，参考eBURST v.3 软件系统确定单克隆复杂性菌株之间的单个位点的变异信息，从而快速获得该菌株的流行病学方面信息。

表3　粪肠球菌 MLST 分型 7 个等位基因所用引物Table 3　Primers used in MLST of Enterococcus faecalis

2　结果

2.1万古霉素非敏感肠球菌筛选

测定 325 株肠球菌的万古霉素最小抑菌浓度，结果显示有 17 株为万古霉素非敏感菌，包括1 株粪肠球菌，11 株屎肠球菌和 5 株鹑鸡肠球菌。208 株粪肠球菌中检测出 1 株万古霉素耐药菌，检出率为 0.5%。111 株屎肠球菌中共检出11 株万古霉素耐药菌，检出率为 10%。6 株其他肠球菌中共检出 5 株万古霉素中介耐药肠球菌，检出率为 83.3%。检出的万古霉素非敏感肠球菌对万古霉素的最小抑菌浓度见表4。

2.2万古霉素非敏感肠球菌的耐药表型测定

对筛选出的 17 株万古霉素非敏感肠球菌（12 株万古霉素耐药肠球菌和 5 株万古霉素中介耐药肠球菌），进一步测定其对替考拉宁的敏感性，根据菌株对万古霉素和替考拉宁的MIC 值获得菌株的糖肽类耐药表型特征。实验结果显示，1 株万古霉素耐药粪肠球菌和 9 株万古霉素耐药屎肠球菌对万古霉素和替考拉宁均显示较高水平的耐药；2 株屎肠球菌对万古霉素显示较高水平的耐药，而对替考拉宁显示中介耐药（MIC = 16 μg/ml）；5 株鹑鸡肠球菌对万古霉素显示中介耐药（MIC = 8 μg/ml），对替考拉宁敏感（MIC 范围为 0.06 ～ 0.5 μg/ml）。

2.3万古霉素非敏感肠球菌耐药基因的 PCR 检测

对筛选出的万古霉素非敏感肠球菌，用 PCR方法检测万古霉素耐药基因 vanA、vanB、vanC1、vanC2/3。实验过程中平行进行万古霉素敏感肠球菌（临床菌及标准菌）和万古霉素耐药标准肠球菌的耐药基因扩增，作为阴性和阳性对照，实验结果见表4，实验菌株电泳图谱见图1。所有 17 株万古霉素非敏感肠球菌中均检测到万古霉素耐药基因，其中 1 株万古霉素耐药粪肠球菌和 11 株万古霉素耐药屎肠球菌为 vanA 型，对万古霉素中介耐药的 5 株鹑鸡肠球菌为 vanC1 型，所有菌株中均未扩增出 vanB 基因。将部分阳性菌株 PCR 产物送样测序，测序结果显示与 PubMed 数据库一致。

2.4用 ERIC-PCR 技术进行菌株的同源性分析

应用 ERIC-PCR 技术对包括万古霉素非敏感临床分离肠球菌、万古霉素敏感标准菌、万古霉素耐药标准菌及万古霉素敏感临床分离菌的共 28 株菌进行同源性分析，结果见表4 和图2。根据ERIC 图谱特点，28 株菌株共分为 9 个谱型。粪肠球菌 VSE 标准菌 ATCC29212 显示出与临床分离 VSE 粪肠球菌 0911 相似的 A 型 ERIC 图谱。VanB 型 VRE 粪肠球菌 ATCC51299、粪肠球菌 EFL4041、粪肠球菌 ATCC700802 具有相似的B 型 ERIC 图谱，并且该图谱与粪肠球菌 HH22相近，而同属于 VanB 型的粪肠球菌 ATCC51575则显示出与此不同的 C 型图谱，说明该菌株与上述菌株同源性较差。VanA 型粪肠球菌 0909 显示出与 VSE 粪肠球菌 0910 相似的 E 型谱图。VanA 标准屎肠球菌 ATCC700221 与临床分离VSE 屎肠球菌 0809 和临床分离 VanA 型屎肠球菌 1202 显示相似的 G 型谱图。而大多数 VanA屎肠球菌则显示 F 型谱图。VanA 型屎肠球菌的其他谱图类型还包括 H 型和 I 型。VanA 型屎肠球菌 0607、0925、1104 和 VanC1 型鹑鸡肠球菌0610 未检测出 ERIC 图谱，而 VanC1 型鹑鸡肠球菌均显示 D 型谱图。

表4　实验所用肠球菌表型、基因型及 ERIC 分型结果Table 4　Phenotype， genotype and ERIC typing analysis results for the tested enterococci

A： vanA； B： vanB； C： vanC1； 1： E. faecalis ATCC29212 （VSE）； 2： E. faecalis 0910 （VSE）； 3： E. faecium ATCC700221 （vanA positive）； 4： E. faecalis 0909；5： E. faecium 1103； 6： E. faecalis ATCC51299 （vanB positive）； 7： E. faecalis ATCC51575 （vanB positive）； 8： E. faecalis EFL4041； 9： E. gallinarum 0810；10： E. gallinarum 0926； 11： E. gallinarum 0610； 12： E. gallinarum 0614； M： Marker图1　万古霉素非敏感肠球菌基因型检测代表性图谱Figure 1　Electrophoresis analysis figures for genotype detection of representative vancomycin nonsusceptible enterococci

M： Marker； 1 - 6， 8 - 10： E. faecalis ATCC29212， ATCC51299， EFL4041， ATCC700802， ATCC51575， HH22， 0909， 0910， 0911； 7， 11， 13， 14，15： E. gallinarum 0810， 0926， 0609， 0610， 0614； 12， 16 - 28： E. faecium 0607， 0628， 0629， ATCC700221， 0809， 0810， 0811， 0830， 0921， 0925， 1103， 1104，1201， 1202图2　万古霉素非敏感肠球菌的 ERIC-PCR 电泳检测图谱Figure 2　Electrophoresis analysis of ERIC-PCR results from vancomycin nonsusceptible enterococci

2.5用 PFGE 技术进行菌株的同源性分析

采用 PFGE 技术对 17 株万古霉素非敏感肠球菌进行同源性分析，屎肠球菌采用ATCC700802作为对照，粪肠球菌采用 ATCC29212 作为对照，结果见图3 和图4。结果显示，17 株肠球菌表现出不同的同源性，粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌不同种属之间差异较大，同源性系数均在 50%以下，同属于屎肠球菌的 11株 vanA 型耐药菌株不属于同一型，可见不属于单克隆流行播散。

2.6用 MLST 技术进行菌株的同源性分析

采用 MLST 技术对 11株临床万古霉素非敏感屎肠球菌和 1 株万古霉素非敏感粪肠球菌进行同源性分析。屎肠球菌以 ATCC700221 作为对照，粪肠球菌以 ATCC51299 作为对照，结果见表5和表6。万古霉素非敏感屎肠球菌共分为 6 个 ST型，其中两株为 ST17，两株为 ST323 型，四株为ST78，另三株分别属 ST571、ST262、ST203，ST78、ST203、ST17 属于同一个克隆复合型 CC17。1 株临床的万古霉素非敏感粪肠球菌属于 ST4 型。

M： MidRange PFG marker I （15.0， 33.5， 48.5， 63.5， 82.0， 97.0， 112.0， 130.5， 145.5， 160.5， 179.0， 194.0， 209.0， 227.5， 242.5， 257.5， 276.0， 291.0）； 1， 2， 4 - 12：E. faecium ATCC700802， 0607， 0628， 0629， 0811， 0830， 0921， 0925， 1103， 1201， 1202； 13 - 14： E. faecalis ATCC29212， 0909； 3， 15 - 18： E. gallinarum 0610，0609， 0614， 0810， 0926图3　万古霉素非敏感肠球菌的 PFGE 电泳图Figure 3　Electrophoresis analysis of PFGE results from vancomycin nonsusceptible enterococci

图4　万古霉素非敏感肠球菌的 PFGE 聚类图Figure 4　Hierarchical cluster analysis of PFGE results from vancomycin nonsusceptible enterococci

3　讨论

万古霉素作用于细菌细胞壁，通过与细菌胞壁上的以 D-丙氨酸-D-丙氨酰为末端的肽聚糖前体小肽特异性结合使细菌细胞壁合成受阻而死亡。万古霉素耐药肠球菌由于可产生一种以 D-丙氨酸-D-乳酸或 D-丙氨酸-D-丝氨酸为末端的肽聚糖前体，使万古霉素与之无法结合而耐药。根据菌株对万古霉素和替考拉宁的不同耐药水平，VRE 可分为多种表型，其中具有重要临床意义的耐药表型为vanA 型以及 vanB 型，两者耐药菌株多见于屎肠球菌和粪肠球菌，表现对万古霉素的高水平耐药或异质性耐药，并且易于转移。而 vanC 型耐药通常是固有型的，主要存在于鹑鸡肠球菌（vanC1 型）或铅黄肠球菌、黄色肠球菌（vanC2/3）等［17-18］，对万古霉素低水平耐药。

本研究中，我们通过琼脂平皿筛选法对实验室保存的 325 株北京地区临床分离肠球菌进行了VRE 菌株筛选，并进一步检测了这些菌株对替考拉宁的敏感性。结果共筛选出 17 株万古霉素非敏感菌，包括 1 株粪肠球菌，11 株屎肠球菌和 5 株鹑鸡肠球菌。其中 208 株粪肠球菌中检测出 1 株VRE，检出率为 0.5%。111 株屎肠球菌中检出11 株 VRE，检出率为 10%。而 6 株其他肠球菌中共检出 5 株万古霉素中介耐药肠球菌，检出率为 83.3%。结果与已有报道相近，VRE 在我国粪肠球菌中检出率低，但在屎肠球菌中占有较高的比例［6-7， 18-19］，值得注意。对这些菌株进一步的替考拉宁敏感度测定结果显示，粪肠球菌 VRE 和大多数屎肠球菌 VRE 菌对替考拉宁耐药，呈现 VanA 型表型；5 株鹑鸡肠球菌 VRE 对替考拉宁敏感，呈现 VanC 型表型。

表5　粪肠球菌 MLST 分型结果Table 5　MLST typing analysis results for the tested Enterococcus faecalis

表6　屎肠球菌 MLST 分型结果Table 6　MLST typing analysis results for the tested Enterococcus faecium

对万古霉素非敏感肠球菌进行 vanA、vanB、vanC 的 PCR 检测结果显示，与表型一致，万古霉素耐药、替考拉宁耐药的粪肠球菌和屎肠球菌VRE 显示 vanA 阳性 PCR 结果，而万古霉素中度敏感、替考拉宁敏感的鹑鸡肠球菌则显示 vanC1阳性结果，实验过程中未发现 vanB 型 VRE。VanA型万古霉素耐药肠球菌对万古霉素和替考拉宁均耐药，并且耐药性易于转移至其他肠球菌，甚至金黄色葡萄球菌［20］，对临床危害大。

用于分子流行病学研究的技术包括扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性内切酶片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机引物扩增 DNA 多态性分型（random amplified polymorphim DNA，RAPD）、PFGE、MLST、ERIC-PCR 等，其中 ERIC-PCR 具有操作简单，灵敏度高等特点，在分子流行病学领域得到广泛应用。ERIC 序列［14］是主要存在于肠道细菌基因间的重复序列，可以形成稳定的茎环结构，定位于基因组内可转录的非编码区域或者与转录有关的区域。该序列长 124 ～ 127 bp，并且在其中心存在高度保守、长约 40 bp 的核心反向重复序列。ERIC-PCR 技术是利用 ERIC 核心的高度保守序列设计引物进行 PCR，扩增两个 ERIC 序列之间的 DNA 片段。本研究中以 ERIC 序列为引物的结合位点，通过聚合酶链反应扩增肠球菌的基因，对其进行分子流行病学研究。ERIC 受试菌株共分为9 个 ERIC 谱型，其中本次实验中检测出的临床分离 vanA 型 VRE 粪肠球菌 0909 显示出与 VSE粪肠球菌 0910 相似的 E 型谱图。11 株 vanA 型临床分离 VRE 屎肠球菌中，3 株未检测到 ERIC谱图，5 株显示 F 型谱图，1 株显示 H 型谱图，1 株显示 I 型谱图，而临床分离 vanA 型屎肠球菌 1202 与 vanA 型标准屎肠球菌 ATCC700221和临床分离 VSE 屎肠球菌 0809 显示相似的 G型谱图。4 株 vanC1 型鹑鸡肠球菌显示 D 型谱图，而 1 株vanC1 型鹑鸡肠球菌 0610 未检测到ERIC 条带。上述结果显示，检测到 ERIC 条带的8 株 vanA 型屎肠球菌 5 株具有相似的 ERIC 图谱（F 型），说明万古霉素耐药存在同源性传播的可能性。同时，vanA 型粪肠球菌 0909 和 vanA 型屎肠球菌 1202 分别与相应的敏感菌株具有类似的 ERIC 图谱，说明耐药菌株可能经由敏感菌株获得 vanA 耐药基因而产生。PFGE 适用于比较确定的高度变异片段，具有高分辨力，但是不适用于进行全面的流行病学调查，且不同实验室间重复性较差，而 MLST 具有一套标准化的技术，在不同实验室间重复性较好，可用来比较进化较慢的位点。采用 PFGE 技术和 MLST 技术分析临床万古霉素非敏感肠球菌分子流行病学特征，PFGE 实验结果表明万古霉素非敏感屎肠球菌 81.8%（9/11）相似性在 55% 以上，屎肠球菌、粪肠球菌、鹑鸡肠球菌不同种属之间差异较大。MLST 分型结果将所有的万古霉素非敏感屎肠球菌分成六型（ST17、ST78、ST203、ST323、ST571、ST262），其中 ST17、ST203、ST571、ST262 占 9.1%，ST78 占 36.3%，ST323 占 18.2%。万古霉素耐药屎肠球菌分型结果与国内发现的万古霉素耐药肠球菌的流行株分型情况相似［21-23］，均含有 ST78 和 ST203，ST78 是传播最为广泛的一个 ST 型，ST17、ST203、ST78、ST323 属于同一个克隆复合型 CC17。CC17 克隆株是医院的优势菌群，已分布在世界各地，曾多次造成院内暴发流行［24-25］。仅有的一株万古霉素耐药粪肠球菌为 ST4 型，属于 CC4 克隆株，这株克隆株并不属于临床大量出现的菌株，但是此克隆株曾在其他的亚太国家造成严重感染。

参考文献

［1］ Leclercq R， Derlot E， Duval J， et al. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N Engl J Med，1988， 319（3）：157-161.

［2］ Uttley AHC， Woodford N， Johnson AP， et al. Vancomycin-resistant enterococci. Lancet， 1988， 1（8575-8576）：57-58.

［3］ Tenover FC， MeDonald LC. Vancomycin-resistant staphylococci and enterococci： epidemiology and control. Curr Opin Infect Dis， 2005，18（4）：300-305.

［4］ Centers for Disease Control and Prevention （CDC）， National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases （NCEZID）， Division of Healthcare Quality Promotion （DHQP）. Antibiotic resistance threats in the United States， 2013. （2014-07-17） ［2016-01-03］. http：// www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/.

［5］ Bonten MJ， Willems R， Weinstein RA. Vancomycin-resistant enterococci： why are they here， and where do they come from？ Lancet Infect Dis， 2001， 1（5）：314-325.

［6］ Wang F. CHINET 2005 surveillance of bacterial resistance in China. Chin J Infect Chemother， 2006， 6（5）：289-295. （in Chinese）汪复. 2005中国CHINET细菌耐药性监测结果. 中国感染与化疗杂志， 2006， 6（5）：289-295.

［7］ Hu FP， Zhu DM， Wang F， et al. CHINET 2013 surveillance of bacterial resistance in China. Chin J Infect Chemother， 2014， 15（5）：365-374. （in Chinese）胡付品， 朱德妹， 汪复， 等. 2013年中国CHINET细菌耐药性监测.中国感染与化疗杂志， 2014， 15（5）：365-374.

［8］ Cetinkaya Y， Falk P， Mayhall CG. Vancomycin-resistant enterococci. Clin Microbiol Rev， 2000， 13（4）：686-707.

［9］ Courvalin P. Vancomycin resistance in gram-positive cocci. Clin Infect Dis， 2006， 42 Suppl 1：S25-S34.

［10］ Boyd DA， Willey BM， Fawcett D， et al. Molecular characterization ofEnterococcus faecalis N06-0364 with low-level vancomycin resistance harboring a novel D-Ala-D-Ser gene cluster， vanL. Antimicrob Agents Chemother， 2008， 52（7）：2667-2672.

［11］ Xu X， Lin D， Yan G， et al. vanM， a new glycopeptide resistance gene cluster found in Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemoter，2010， 54（11）：4643-4647.

［12］ Lebreton F， Depardieu F， Bourdon N， et al. D-Ala-d-Ser VanN-type transferable vancomycin resistance in Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（10）：4606-4612.

［13］ Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing； twenty-third informational supplement. CLSI document M100-S23. Wayne， PA：Clinical and Laboratory Standards Institute， 2013.

［14］ Beli JM， Paton JC， Turnidge J. Emergence of vancomycin-resistant Enterococci in Australia： phenotypic and genotypic characteristics of isolates. J Clin Microb， 1998， 36（8）：2187-2190.

［15］ Versalovic J， Koeuth T， Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res， 1991， 19（24）：6823-6831.

［16］ Jahan M， Zhanel GG， Sparling R， et al. Horizontal transfer of antibiotic resistance from Enterococcus faecium of fermented meat origin to clinical isolates of E.faecium and Enterococcus faecalis. Int J Food Microbiol， 2015， 199：78-85.

［17］ Moura TM， Cassenego AP， Campos FS， et al. Detection of vanC1 gene transcription in vancomycin-susceptible Enterococcus faecalis. Mem Inst Oswaldo Cruz， 2013， 108（4）：453-456.

［18］ Wang F， Zhu DM， Hu FP， et al. CHINET 2009 surveillance of bacterial resistance in China. Chin J Infect Chemother， 2010， 10（5）：325-334. （in Chinese）汪复， 朱德妹， 胡付品， 等. 2009年中国CHINET细菌耐药性监测.中国感染与化疗杂志， 2010， 10（5）：325-334.

［19］ Zhu DM， Wang F， Hu FP， et al. CHINET 2010 surveillance of bacterial resistance in China. Chin J Infect Chemother， 2011， 11（5）：321-329. （in Chinese）朱德妹， 汪复， 胡付品， 等. 2010年中国CHINET细菌耐药性监测.中国感染与化疗杂志， 2011， 11（5）：321-329.

［20］ Centers for Disease Control and Prevention （CDC）. Staphylococcus aureus resistant to vancomycin--United States， 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep， 2002， 51（26）：565-567.

［21］ Sun H， Wang H， Xu Y， et al. Molecular characterization of vancomycin-resistant Enterococcus spp. clinical isolates recovered from hospitalized patients among several medical institutions in China. Diagn Microbiol Infect Dis， 2012， 74（4）：399-403.

［22］ Zheng B， Tomita H， Xiao YH， et al. Molecular characterization of vancomycin-resistant enterococcus faecium isolates from mainland China. J Clin Microbiol， 2007， 45（9）：2813-2818.

［23］ Yang J， Jiang Y， Guo L， et al. Prevalence of diverse clones of vancomycin-resistant enterococcus faecium ST78 in a Chinese hospital. Microb Drug Resist， 2015. ［Epub ahead of print］

［24］ Hsieh YC， Lee WS， Ou TY， et al. Clonal spread of CC17 vancomycin-resistant Enterococcus faecium with multilocus sequence type 78 （ST78） and a novel ST444 in Taiwan. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2010， 29（1）：25-30.

［25］ Camargo IL， Gilmore MS， Darini AL. Multilocus sequence typing and analysis of putative virulence factors in vancomycin-resistant and vancomycin-sensitive Enterococcus faecium isolates from Brazil. Clin Microbiol Infect， 2006， 12（11）：1123-1130.

Author Affiliations: Department of Pharmacology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （SUN Lang， NIE Tong-ying， HU Xin-xin， LI Cong-ran， YOU Xue-fu）；Department of Respiratory Medicine， First Affiliated Hospital of Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China （LIU Jian-hua）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):206-215

·协会之窗·

Screening and genotype analysis of vancomycin-non-susceptible enterococci

SUN Lang， LIU Jian-hua， NIE Tong-ying， HU Xin-xin， LI Cong-ran， YOU Xue-fu

【Abstract】

ObjectiveTo screen vancomycin-non-susceptible enterococci from 325 strains of clinical enterococci isolated from 2006 to 2012，and to further conduct the resistance phenotype， resistance genotype and homology analysis of the vancomycin-non-susceptible enterococci.

MethodsScreening of the vancomycin-non-susceptible enterococci and detection of the susceptibility to teicoplanin were conducted by blood agar dilution method. Resistance genotypes were determined by PCR method. Homology analysis was carried out by ERIC-PCR， PFGE and MLST technology.

ResultsTotally 17 strains of vancomycin-non-susceptible enterococci were screened out from 325 strains of clinical enterococci，including 1 strain of E. faecalis， 11 strains of E. faecium， and 5 strains of E. gallinarum. 1 strain of E. faecalis and 11 strains of E. faecium showed high level resistance to vancomycin， and resistance or intermediate resistance to teicoplanin， PCR results suggesting vanA genotype. 5 strains of E. gallinarum demonstrated intermediate resistance to vancomycin， and susceptibility to teicoplanin，PCR results suggesting vanC1 genotype. ERIC homology analysis results showed that most of isolates with the same genotype demonstrated similar ERIC profiles. Pulsed-field gel electrophoresis results of 17 strains of vancomycin-non-susceptible enterococci showed differences in PFGE type. 1 strain of E. faecalis displayed ST4 in multilocus sequence typing analysis， and 11 strains of E. faecium isolates were typed into six different sequence types （STs）， including ST17， ST78， ST203， ST323， ST571， ST262. Four of the E. faecium isolates belonged to ST78， which was the most prevalent ST type in E. faecium of this study.

ConclusionsIn our country， vancomycin resistance rate is low in E. faecalis， but vancomycin resistance is relatively a seriousproblem in E. faecium. And the resistant isolates usually carry the vanA gene favoring resistance transfer between different isolates. Homology analysis of vancomycin resistant isolates suggests the possibility of homologic transfer of vancomycin resistance.

【Key words】Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Vancomycin resistance；Genotype；Multilocus sequence typin；Enterobacterial repetitive integenic consensus

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.003

基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划）（2014AA021101）； “十二五” 国家科技重大专项（2012ZX09301002-005）

通信作者：李聪然，Email：cong5885@aliyun.com；游雪甫，Email：xuefuyou@hotmail.com

收稿日期：2016-01-22

Corresponding Authors: LI Cong-ran， Email： cong5885@aliyun.com； YOU Xue-fu， Email： xuefuyou@hotmail.com