人脐带华通胶细胞外基质源性软骨组织工程支架的制备及相关研究

刘舒云，侯克东，鹿亮，黄靖香，袁玫，许文静，卢世璧，郭全义



人脐带华通胶细胞外基质源性软骨组织工程支架的制备及相关研究

刘舒云，侯克东，鹿亮，黄靖香，袁玫，许文静，卢世璧，郭全义

【摘要】

目的采用人脐带华通胶细胞外基质为材料制备软骨组织工程支架，并对其性能进行相关检测。

方法人脐带去除外膜及动、静脉，通过机械粉碎、差速离心去细胞、冷冻干燥、紫外及化学交联等方法将华通胶组织制备成三维多孔的软骨组织工程支架，并通过组织化学和免疫组织化学方法检测其成分保留情况；将人骨髓间充质干细胞复合至支架，光镜及电镜下观察细胞在支架上的生长状况及基质分泌情况，初步了解其生物相容性；将人脐带去细胞华通胶支架植入兔背部皮下，通过组织化学及 CD4+/CD8+T淋巴细胞免疫荧光染色，了解其炎症情况及免疫原性。

结果制备得到的人脐带华通胶细胞外基质源性支架为三维多孔支架，保留了华通胶中糖胺多糖和 II 型胶原等成分，糖胺多糖含量为 7.05%，总胶原含量为 22.5%；接种于支架上的细胞黏附于支架孔壁上，生长状态良好，并有基质分泌；在体试验未见明显免疫反应。

结论人脐带华通胶细胞外基质的成分与软骨细胞外基质类似，有利于细胞黏附和生长，无明显免疫原性，是一种较有前景的软骨组织工程支架材料。

【关键词】华通胶；细胞外基质；组织工程；支架（骨科）

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(3):200-205

作者单位：100853 北京，解放军总医院骨科研究所北京市再生医学重点实验室/全军战创伤重点实验室

软骨损伤难以自我修复，传统治疗方法无法达到满意疗效。组织工程是近年来兴起的修复缺损组织的方法，为治疗软骨缺损带来了新的希望。组织工程包含三方面要素，即支架、种子细胞和细胞因子。目前支架材料主要包括两大类，即合成材料和天然材料，天然材料成分接近天然软骨，细胞毒性小，生物相容性好。软骨细胞外基质来源的软骨支架由于基质成分及其比例与天然软骨更为类似，因此成为近年来众多研究者关注的热点。但人源性软骨细胞外基质来源有限，成为限制其广泛研究和应用的因素。

脐带是连接母体和胎儿的组织，包含两条动脉和一条静脉，周围包绕着华通胶和脐带外膜，胎儿分娩后即成为废弃物。华通胶的生理功能是保护脐带血管，防止其受外力挤压，如子宫收缩、胎儿活动等引起的血管受压，从而保障正常的脐带血运［1-2］，该作用与关节软骨缓冲受力、减少变形、损伤及摩擦的作用相似。另外，脐带华通胶富含透明质酸、硫酸化糖胺多糖及胶原等成分，与软骨的细胞外基质成分类似。此外，脐带华通胶中无血管滋养管、神经、淋巴等结构，结构特征也与软骨类似［3-9］，同时因其属于分娩废弃物，不存在伦理问题，且来源丰富。基于上述特征，我们认为脐带华通胶可能是一种较好的软骨组织工程支架材料的来源。本研究采用去细胞、冻干及交联的方法制备出去细胞人脐带华通胶软骨组织工程用支架，并对其成分、结构、细胞毒性以及对细胞行为的影响、皮下免疫反应等进行初步的研究。

1　材料和方法

1.1材料

正常足月妊娠新生儿脐带由解放军总医院妇产科提供；戊二醛、锇酸、醋酸异戊酯、六甲基二硅胺烷（HMDS）、双氧水、胰酶消化液、碳化二亚胺、甲苯胺蓝、番红花 O 染色所用试剂均为北京化学试剂公司生产；鼠抗人 II 型胶原抗体、鼠抗人 I 型胶原抗体及鼠抗人 Aggrecan 抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗抗体购自北京世安科兴有限公司；DMEM 细胞培养基购自美国Sigma 公司；胎牛血清购自北京元亨金马生物科技有限公司；小鼠抗兔 CD4 和 CD8 单克隆抗体购自美国 Research Diagnostics 公司；荧光素 TRITC标记抗小鼠 IgG 购自北京中山生物技术公司；新西兰大白兔 6 只购自解放军总医院动物实验中心，合格证号：SCXK（京 2007-0003），饲养于清洁普通环境中；羟脯氨酸测试盒购自南京建成科技有限公司；S-520 型扫描电子显微镜为日本日立公司产品。

1.2方法

1.2.1支架制备于无菌条件下剥离脐带外膜及血管组织，余下的华通胶组织用无菌蒸馏水冲洗，3% 双氧水浸泡 30 min，加入无菌三蒸水在低温下反复粉碎成华通胶匀浆。向匀浆中加入 10 倍体积三蒸水混匀，-20 ℃ 冷冻后于常温融化，反复 3 ～4 次冻融，使残余细胞破碎。将匀浆经 2000 r/min离心 20 min。取上清加入 1% Triton X-100、0.25%胰蛋白酶、Tris-HCl 缓冲液，于 4 ℃ 条件下轻轻搅拌，洗脱 24 h 后，3000 r/min 离心 20 min。上清用 DNase 和 RNase 混合液于 37 ℃ 消化过夜，4 ℃、6000 r/min 条件下离心15 ～ 20 min。充分洗去细胞碎片和残留物质，至 pH 7.0，取上层匀浆，10 000 r/min、4 ℃ 条件下离心 40 min，收集沉淀，即为去细胞的纳米级脐带华通胶浆料。

将收集到的人脐带华通胶浆料调整为 3% （W/V）混悬液，充分搅拌均匀，注入聚乙烯圆筒模具中，-20 ℃ 预冻 30 min，放入冷冻干燥机中进行冻干，48 h 后形成三维多孔海绵支架。将支架置于 258 nm 波长紫外线照射下交联 8 h，再于含 20 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和 50 mmol/L 乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺的 95%（V/V）乙醇溶液中 4 ℃ 下交联 24 h。无菌 PBS 漂洗浸泡 2 h，三蒸水漂洗去除残余交联剂，再次冻干，密封袋保存，60Co 照射消毒，4 ℃ 条件下保存备用［10-12］。

1.2.2细胞复合支架支架于培养液中浸泡 20 min后置于 6 孔板中，人 BMSCs以 1 × 107个/ml 的密度接种至支架上，37 ℃ 孵育 2 h，待细胞黏附于支架后，加入完全培养液 2 ～ 3 ml/孔。于 37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养 2 ～ 3 d，以光学显微镜及电子显微镜观察细胞形态及黏附情况。

1.2.3组织化学和免疫组织化学染色将人脐带组织冰冻切片（10 μm）及华通胶浆料涂片室温晾干，分别用 95% 酒精固定 10 min，室温晾干，进行 HE 和甲苯胺蓝染色。免疫组化染色时，将固定、晾干的组织片于 3% 双氧水中浸泡 10 min， 1 × PBS 缓冲液漂洗 3 次，5 min/次。免疫组化一抗（鼠抗人 II 型胶原、I 型胶原、Aggrecan 抗体）用 1 × PBS 缓冲液按 1∶200 比例稀释，滴至盖玻片上，4 ℃ 孵育过夜后，1 × PBS 缓冲液洗 3 次，5 min/次，室温下二抗孵育 15 min，1 × PBS 缓冲液洗 3 次，5 min/次，DAB 显色液室温孵育 5 min，洗去多余显色液，苏木素染核 5 min，过盐酸乙醇分化，水中浸泡 5 min，酒精系列脱水，二甲苯透明，树脂封片后显微镜下观察。

1.2.4糖胺多糖和总胶原含量检测应用二甲基亚甲蓝（DMB）法，切取冻干华通胶细胞外基质源性支架，称重，加入含有木瓜蛋白酶的裂解液进行裂解，离心吸取上清，100 μl 裂解液加入 3 ml DMB显色液，糖胺多糖中的硫酸软骨素与二甲基亚甲蓝带正电染料结合，产生颜色，紫外分光光度计检测。根据羟脯氨酸测试盒说明，进行显色，紫外分光光度计测定羟脯氨酸含量，换算为总胶原蛋白含量（羟脯氨酸占胶原蛋白 13.4%）。

1.2.5电镜观察用锋利刀片切取 10 mm2× 2 mm 大小样品，1 × PBS 缓冲液清洗，依次进行2.5% 戊二醛及 1% 锇酸固定，1 × PBS 缓冲液清洗样品，酒精梯度脱水（50%、75%、90%、100%），醋酸戊酯置换 40 min，六甲基二硅胺烷干燥，表面喷镀导电金属，扫描电镜观察。

1.2.6体内植入实验取新西兰大白兔 6 只，常规背部备皮、消毒，取正中切口长约 7 cm，依次切开皮肤、皮下组织。将大白兔随机平均分为2 组：实验组在兔背部深筋膜与肌膜之间埋植大小为 0.8 cm × 0.5 cm 的脱细胞华通胶支架；对照组同法皮下埋植兔脱细胞软骨支架。每只兔背部均设3 个埋植点，各埋植点间距约 3 cm。皮肤切口均用 3-0 细丝线缝合，术后分组饲养。分别在埋植后1、2、4 周时取支架以及周围组织行 HE 染色及CD4+/CD8+T 淋巴细胞免疫组织化学检测，观察炎症反应和细胞免疫情况［13］。

2　结果

2.1人脐带华通胶成分检测

组织化学和免疫组织化学染色可见脐带华通胶番红花 O 染色、甲苯胺蓝染色、II 型胶原、I 型胶原及 Aggrecan 免疫组化染色均呈阳性（图1），表明人脐带华通胶中富含糖胺多糖、II 型胶原、I 型胶原和软骨蛋白聚糖等物质，基质成分与软骨类似。

图1　脐带华通胶组织病理染色（A：足月健康人脐带；B：番红花 O 染色；C：甲苯胺蓝染色；D：II 型胶原免疫组化染色；E：I 型胶原免疫组化染色；F：Aggrecan免疫组化染色）Figure 1　Histochemistry and immunochemistry staining of human umbilical cord Wharton’s jelly （A： Full-term healthy human umbilical cord； B： Safranine O staining； C： Toluidine blue staining； D： Type II collagen immunochemistry staining； E： Type I collagen immunochemistry staining； F： Aggrecan immunochemistry staining）

图2　人脐带华通胶及其细胞外基质的观察（A：剥取的人脐带华通胶大体观察；B：去细胞浆料甲苯胺蓝染色；C：去细胞浆料 II 型胶原免疫组化染色；D：去细胞浆料电镜观察）Figure 2　Observation of human umbilical cord Wharton’s jelly and its derived extracellular matrix （A： Macroview of the stripped-off human umbilical cord Wharton’s jelly； B： Toluidine blue staining of WJ-ECM； C： Type II collagen immunochemistry staining of WJ-ECM； D： SEM observation of WJ-ECM）

2.2去细胞华通胶支架的制备

所获华通胶浆料经电镜观察，显示含大量胶原微丝及蛋白聚糖（图2）。将浆料注入模具，通过冷冻干燥法成形，并进行物理及化学交联，所得支架为白色、多孔结构，扫描电镜观察可见支架内部孔隙相互连通，孔径大小较均一，直径多分布于200 μm 左右（图3）。

2.3糖胺多糖和总胶原含量检测

通过 DMB 法检测华通胶细胞外基质源性支架的糖胺多糖含量为 7.05%，羟脯氨酸法检测支架总胶原含量为 22.5%，表明该支架中保留了较多的糖胺多糖和胶原成分。

图3　人脐带华通胶细胞外基质源性支架的大体观察（A）和电镜观察（B）Figure 3　Macroview （A） and SEM observation （B） of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold

图4　人 BMSCs 接种于人脐带华通胶细胞外基质源性支架 48 h 后的形态观察（A、B：光镜；C、D、E：电镜）Figure 4　Observation of human BMSCs seeded in human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold after 48 h （A， B： Light microscope； C， D， E： SEM ）

图5　人脐带华通胶细胞外基质源性支架体内免疫反应（A ～ C：HE 染色；D ～ F： CD4+T 细胞免疫荧光染色；G ～ I：CD8+T细胞免疫荧光染色；红色荧光为 CD4+/CD8+T 细胞，蓝色荧光为 hoechst 33258 细胞核染色）Figure 5　Immunoreaction of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold in rabbit subcutaneous circumstance （A - C： HE staining； D - F： CD4+T cell immunofluorescence； G - I： CD8+T cell immunofluorescence； red fluorescence is CD4+/CD8+T cell； blue fluorescence is hoechst 33258 nucleus staining）

2.4细胞活性检测

将人 BMSCs 以 1 × 107个/ml 的密度接种于华通胶细胞外基质源性支架上，培养箱内培养 48 ～72 h，光镜下观察可见细胞贴附于支架内部，电子显微镜下可见细胞生长状态良好，并有基质分泌（图4）。

2.5细胞免疫反应

术后 1 周去细胞华通胶支架无明显炎症细胞浸润，CD4+和 CD8+单克隆抗体免疫荧光染色阴性；术后 2 周时，见有一定量的炎症细胞浸润，以中性白细胞为主，散在数个 CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞；术后 4 周时，去细胞华通胶支架有部分降解，且浸润的炎症细胞减少（图5）；对照组兔脱细胞软骨支架及周围埋藏部位组织未见明显淋巴细胞浸润。结果表明，去细胞华通胶支架未诱发细胞免疫排斥，只有轻度的炎症反应。

3　讨论

软骨组织工程支架的制备材料主要包括合成高分子材料和天然材料两大类。合成高分子材料主要有聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）及其共聚物（PLGA）等，它们虽然具有可控的强度、降解速度、微结构等优点，但其降解产物均为酸性，不利于种植其上的软骨细胞的生长和增殖，生物相容性不理想。另外，合成材料表面没有天然材料所具有的特定的细胞识别信号，且亲水性差，不利于软骨细胞的黏附、增殖和基质合成。天然材料主要有I 型胶原、壳聚糖、藻酸盐、几丁质、纤维蛋白、透明质酸，它们的优点在于生物相容性好，且更易于细胞附着，但其与天然关节软骨细胞外基质成分仍存在较大差别，且缺乏软骨细胞特定的细胞识别信号。软骨细胞外基质源性支架是近年来出现的软骨支架研究新方向，它具备了天然软骨细胞外基质的成分和配比，能够模拟天然的软骨细胞微环境，利于软骨细胞保持表型、细胞增殖和基质合成，是一种富有前景的软骨组织工程支架材料［2］。但目前软骨细胞外基质主要来源于尸体取材，材料来源存在较大限制，不利于其广泛应用。

脐带华通胶细胞外基质在成分组成及比例上与软骨细胞外基质类似，华通胶具有与软骨相似的生理学功能［1-9］，缺乏血管和神经，内部结构特点与软骨类似，并且其来源广泛，不存在伦理学问题，因此有望成为软骨细胞外基质的替代材料，用于软骨组织工程支架的制备。本研究通过粉碎、去细胞、差速离心、冻干、交联等方法制备得到人脐带华通胶细胞外基质源性支架，扫描电镜显示支架内部孔隙相互连通，孔径范围分布在 200 μm左右。组织化学及免疫组织化学结果显示支架的糖胺多糖、II 型胶原染色均为阳性，定量结果也显示经去细胞等方法制备获得的支架仍保留了华通胶细胞外基质中的主要成分，并与软骨细胞外基质成分类似。光镜及电镜观察显示接种于支架内的人 BMSCs贴附于支架孔隙内壁，生长状态良好，可分泌基质。皮下植入实验结果显示，人脐带华通胶细胞外基质源性支架埋藏于兔背部皮下，未引起明显免疫反应。以上结果证明，脐带华通胶细胞外基质可用于制备软骨组织工程支架，该支架具有与正常软骨细胞外基质类似的组成成分，能够给接种的种子细胞提供良好的生长和分化的微环境，是一种具有广阔应用前景的软骨组织工程支架。

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Author Affiliation: Institute of Othopaedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):200-205

·协会之窗·

Preparation and its related study of the engineering scaffold from human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix-derived cartilage

LIU Shu-yun， HOU Ke-dong， LU Liang， HUANG Jing-xiang， YUAN Mei， XU Wen-jing， LU Shi-bi， GUO Quan-yi

【Abstract】

ObjectiveTo fabricate a novel scaffold of cartilage tissue engineering with human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix and assessed it’s function in vitro.

MethodsFull-term healthy human umbilical cords were collected in aseptic condition and the arteries and veins were removed. The remaining Wharton’s jelly was pulverized， centrifugated， lyophilized and cross-linked， and thus was fabricated into a three-dimensional porous scaffold for cartilage tissue engineering.

ResultsThe 3-D porous scaffold retained glycosaminoglycan and collagen content of human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix， as the glycosaminoglycan content accounted for 7.05% and total collagen accounted for 22.5%. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells adhered to the scaffold， and growed well. The human umbilical Wharton’s jelly extracellular matrix-derived scaffold did not evoke immune rejection in the subcutaneous implantation of rabbit backs.

ConclusionThe human umbilical cord Wharton’s jelly extracellular matrix has very similar chemical component with cartilage extracellular matrix. It benefits for cell adherence and proliferation， and does not evoke immune rejection in vivo， so we propose it to be an ideal material for cartilage tissue engineering.

【Key words】Wharton’s jelly；Extracellular matrix；Tissue engineering；Scaffold

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.002

基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划）（2012AA020502、2015AA020303）；国家自然科学基金重点项目（21134004）；国家自然科学基金面上项目（81472092）

通信作者：郭全义，Email：doctorguo_301@163.com

收稿日期：2016-02-18

Corresponding Author:GUO Quan-yi， Email： doctorguo_301@163.com