酵母UDP-葡萄糖合成途径的优化及黄酮葡萄糖苷的合成

王惠敏，杨燕，田雷瑜，周文龙，王伟



酵母UDP-葡萄糖合成途径的优化及黄酮葡萄糖苷的合成

王惠敏，杨燕，田雷瑜，周文龙，王伟

【摘要】

目的研究在酿酒酵母细胞内高表达大肠杆菌 UDP-葡萄糖合成途径的 2 个关键酶对工程酵母细胞的葡萄糖苷化反应活性的影响。

方法利用 PCR 方法获得大肠杆菌磷酸葡萄糖变位酶（PGM）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（GalU）基因，构建整合型表达载体，转化酵母；同时共表达具有催化黄酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖转移酶，研究摇瓶培养条件下 PGM 和 GalU 基因的表达对工程细胞生物催化黄酮类化合物葡萄糖苷化的影响。

结果在酵母细胞内表达大肠杆菌 UDP-葡萄糖合成途径的 2 个关键酶 PGM 和 GalU，提高了组合表达 UDP-葡萄糖转移酶的工程菌生物催化合成野黄芩素-7-O-葡萄糖苷的效率，表明 PGM 和 GalU 基因的高表达能促进 UDP-葡萄糖的合成；所构建的工程菌也能催化木犀草素、柚皮素、白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素 A、黄芩素、槲皮素以及大豆黄酮等黄酮类化合物的葡萄糖苷化。

结论组合表达大肠杆菌 PGM 和 GalU 基因能促进酵母细胞内 UDP-葡萄糖的合成，进而提高了工程细胞催化合成黄酮葡萄糖苷的效率。

【关键词】黄酮类；尿苷二磷酸葡糖；酿酒酵母菌；葡糖磷酸变位酶；葡糖转移酶类

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术， 2016， 11（3）：229-235

作者单位：100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生和计划生育委员会天然药物生物合成重点实验室

黄酮类化合物广泛存在于自然界，具抗氧化、抗肿瘤、抗炎和免疫调节等生物活性，在植物体内多以游离或与糖结合成苷的形式存在［1-2］；大多数在水相中溶解度低，限制其药物剂型的开发。目前提高黄酮类化合物溶解度的主要手段是对其糖苷化修饰，其糖苷化修饰研究最多的是葡萄糖苷化反应。化学修饰法需要对黄酮的酚羟基先进行酰基保护，然后与活化的糖基供体（如糖基三氯乙酰亚胺酯）进行糖苷化反应，最后再高选择性地脱去保护基团获得黄酮糖苷化产物［3］。这种葡萄糖苷化的化学修饰反应步骤复杂，收率低，副产物多，难以进行规模化放大和生产，不具有生产实用价值。

微生物转化法和酶法进行葡萄糖苷化修饰，反应条件温和，无需进行保护和脱保护反应，立体和区域选择性高，可以定向高效地生物催化黄酮苷元的葡萄糖苷化［4-5］。酶促催化需要添加活化的糖基供体 UDP-葡萄糖（uridine diphosphate glucose），由于此前体分子价格较贵，目前该法也仅用于糖基转移酶的功能鉴定，难以实现反应的放大；而利用仅高表达 UDP-葡萄糖转移酶的工程菌直接进行生物催化，由于细胞自身合成活化的 UDP-葡萄糖水平较低，导致生物催化合成葡萄糖苷化产物的水平较低。最近，为提高工程细胞生物催化糖苷化反应的效率，研究报道通过调节胞内的 UDP-葡萄糖生物合成途径，提高细胞合成 UDP-葡萄糖的水平；同时高表达 UDP-葡萄糖转移酶，较大幅度地提高了糖苷化产物的合成水平［6-7］。

酿酒酵母作为真核单细胞生物，不仅具有原核生物（如大肠杆菌等）生长快、易培养和易于进行遗传改造的优点，还可以异源高表达 UDP-葡萄糖转移酶进行葡萄糖苷化修饰［7］。但由于酵母细胞具有较强的葡萄糖苷酶水解活性［8-9］，限制了其进行生物催化合成葡萄糖苷产物的应用；酵母细胞糖苷水解酶对葡萄糖苷修饰的影响已另文报道。本研究以敲除葡萄糖苷酶基因的工程酵母细胞为基础菌株，进行高表达大肠杆菌的 2 个参与 UDP-葡萄糖合成的关键酶，即葡萄糖-6 -磷酸变位酶（phosphoglucomutase，PGM）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase，GalU），提高细胞内源性 UDP-葡萄糖水平；同时共表达已功能鉴定的黄芩 UDP-葡萄糖转移酶，研究所构建工程菌具有催化黄酮类化合物葡萄糖苷化生物催化的活性。

1　材料与方法

1.1菌株和质粒

所使用菌株和构建的质粒见表1，其中宿主菌Escherichia coli Trans1-T1 购自北京全式金生物技术有限公司，酵母 W303-1b 为本实验室保存。

1.2方法

1.2.1表达质粒构建

1.2.1.1含有 PGM 基因表达载体的构建以大肠杆菌的基因组 DNA 为模板，以 GenBank 注册号 EG12144 的核酸序列为基础设计合成引物（表2），利用 2 组引物 PGM_1/PGM_4 和PGM_2/PGM_3 进行巢式-PCR（Nested-PCR）扩增，得到长约为 1.6 kb 的 DNA 片段；然后用限制性内切酶 Nde I 和 Nhe I 酶切，再与用相同酶切的质粒 pδGAPh［10］进行 DNA 连接反应，该载体 pδGAPh 含有酿酒酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter，GAP）启动子、酿酒酵母 δ 整合位点、酿酒酵母终止子（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）和可利用潮霉素 B（hygromycin B，HygB）进行筛选的 HygB 激酶标记基因，经 CaCl2转化法转化大肠杆菌 Trans1-T1，筛选获得阳性克隆，即得到酿酒酵母整合型表达质粒 pδGAPh-PGM。

表1　本研究使用的菌株和质粒Table 1　Strains and plasmids used in this study

表2　本实验使用的 PCR 扩增引物Table 2　PCR primers used in this study

1.2.1.2含有 GalU 基因表达载体的构建以GenBank 注册号 NP_415752 的核酸序列为基础设计合成 PCR 反应引物，采用与 PGM 基因片段相同的克隆方式，把 PCR 扩增获得的 DNA 片段与经 Nde I 和 Nhe I 酶切的质粒 pδGAP'z 进行DNA 连接反应；其中质粒 pδGAP'z 是用引物TyR-ZH1/TyR-ZE1 和质粒 pPICZαA 为模板经PCR 扩增得到博来霉素筛选标记基因 sh ble，再置换质粒 pδGAP'g 上的标记基因 kanMX，该质粒载体 pδGAP'z 含有甲醇酵母 GAP 启动子、酿酒酵母 δ 整合位点、酿酒酵母 PGK1 终止子和可用博来霉素抗性筛选标记基因 sh ble，经 CaCl2转化法转化大肠杆菌 Trans1-T1，筛选获得阳性克隆，即得到酿酒酵母整合型质粒 pδGAP'z-GalU。

1.2.1.3含有 SbGT34 表达载体的构建以含有黄芩 UDP-葡萄糖转移酶基因的质粒 pTWIN1BUGT34 为模板，用引物 SBUGT_N1/SBUGT_X1 经 PCR 扩增获得的已完成功能鉴定的黄芩 UDP-葡萄糖基转移酶基因片段，经 Nde I 和 Xba I 双酶切并亚克隆到 pδGAPg［10］载体，经 CaCl2转化法转化大肠杆菌 Trans1-T1，筛选获得阳性克隆，即得到 pδGAPg-SbGT34 整合型表达载体。

1.2.2酿酒酵母感受态细胞制备及 LiAc 转化方法参照 LiAc 转化法［11］制备酵母感受态细胞和DNA 转化，把转化体系涂布于含有相应抗生素的YPD 平板上筛选，在 30 ℃ 培养箱培养 3 d。将获得的菌株转接于含高浓度抗生素的筛选平板上进行高拷贝整合阳性克隆复筛。

1.2.3阳性克隆的鉴定目的基因转化酵母细胞，筛选获得阳性克隆，然后采用酵母基因组 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。通过 PCR 鉴定确定目的基因是否整合进入宿主的基因组中，最后再以各基因的特异引物对纯化的 PCR 扩增片段进行测序验证。

1.2.4大肠杆菌糖代谢途径 PGM 和 GalU 基因对工程菌催化黄酮底物转化率的影响把已构建的表达质粒 pδGAPh-PGM、pδGAP'z-GalU 和pδGAPg-SbGT34 用限制性内切酶 Not I 进行线性化，然后转化酵母细胞 W303-1b/ES。以获得的工程菌W303-1b/ES/PeG/SbGT34 为实验组，工程菌W303-1b/ES/SbGT34 为对照组鉴定 PGM 和GalU基因的表达对工程菌催化黄酮底物转化率的影响。以野黄芩素为底物鉴定提高 UDP-葡萄糖合成水平的工程菌对黄酮底物糖苷化催化活性的变化，具体做法如下：①挑取单克隆接种于 YPD 液体培养基中，30 ℃，220 r/min，培养至 OD600到 3.0 左右。②按 1% 的接种量转接到 SC 合成液体培养基中，30 ℃，220 r/min 培养约 10 h。③用 SC 培养基调节生物量，使得初始 OD600为 1.0，然后把工程细胞 1 ml 分装于 5 ml 反应瓶中，每种工程菌3 个平行实验，每个反应瓶中加入野黄芩素为反应底物，使得野黄芩素的终浓度为 0.2 mmol/L，30 ℃，165 r/min 反应。④分别于反应 3、6、12、24、48、 72、96 h 取出 3 个平行实验的反应瓶，样品冷干后用 500 μl 甲醇萃取 3 次。把 3 次甲醇萃取液完全挥干后，再用 1 ml 甲醇溶解萃取物，经 0.22 μm滤膜过滤后进行 HPLC 分析。

1.2.5工程菌对不同黄酮类底物的生物催化利用工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 对不同黄酮类化合物包括木犀草素、柚皮素、白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素 A、野黄芩素、黄芩素、槲皮素以及大豆黄酮等进行生物催化，实验方法与 1.2.4 相同。

1.2.6黄酮葡萄糖苷化产物的分析和结构鉴定生物催化产物冷干浓缩，用甲醇溶解后直接利用 HPLC 系统进行分析，C18 色谱柱为 Mightysil RP-18 GP（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相 A 和B 为 H2O（0.05% 三氟乙酸）和乙腈，流速为1 ml/min；洗脱梯度为 0 ～ 25 min（10% ～ 35% B）、25 ～ 27 min（35% ～ 100% B）、27 ～ 32 min（100% B）、32 ～ 35 min（100% ～ 10% B）、35 ～ 40 min（10% B）。采用 HPLC-ESI-MS/MS 以负离子扫描模式进行产物的质谱分析。

2　结果

2.1酿酒酵母工程菌的构建

利用限制性内切酶 Not I 线性化处理质粒pδGAPh-PGM 和 pδGAP'z-GalU，然后转化入基础工程酵母菌株 W303-1b/ES（E 表示 EXG1 基因敲除，S 表示 SPR1 基因敲除），利用含有潮霉素和博来霉素的 YPD 固体培养基进行培养，经筛选获得的阳性克隆用 YPD 液体培养基培养，然后提取阳性克隆的基因组 DNA，对所整合的 PGM 和GalU 基因进行 PCR 鉴定，结果如图1A 和 1B所示，阴性对照菌基因组没有 DNA 扩增条带，阳性对照质粒和阳性克隆都有预期长度的 DNA 片段扩增，再对获得的 DNA 片段纯化并进行 DNA测序验证，即获得工程菌株 W303-1b/ES/PeG（Pe表示表达大肠杆菌 PGM 基因，G 表示表达大肠杆菌 GalU 基因）。

利用限制性内切酶 Not I 线性化质粒pδGAPg-SbGT34，同样采用 LiAc 转化法分别转化酿酒酵母细胞 W303-1b/ES 和 W303-1b/ES/PeG，利用含有 G418 的固体 YPD 培养基进行培养，经筛选获得的阳性克隆用 YPD 液体培养基培养，然后提取阳性克隆的基因组 DNA，对所整合的SbGT34 基因进行 PCR 鉴定，如图1C 所示，工程菌株 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 的 3 个阳性克隆和阳性对照质粒均有预期大小的 DNA 片段扩增，阴性对照有一个较小的非特异性 DNA 片段扩增；再对获得的 DNA 片段纯化并进行 DNA 测序验证，即获得工程菌株 W303-1b/ES/PeG/SbGT34。采用同样的酵母转化方法，筛选获得对照工程菌株W303-1b/ES/SbGT34。

M：DNA 标准分子量；1：阴性对照；2：阳性对照；3 ～ 5：阳性克隆M： DNA ladder； 1： Negative control； 2： Positive control； 3 - 5： Positively engineered strains图1　工程酵母基因组整合的目的基因的 PCR 鉴定（A：PGM DNA 片段；B：GalU DNA 片段；C：SbGT34 DNA 片段）Figure 1　PCR verification results of genetically engineered strains with integration of three heterologous genes （A： PGM DNA fragments； B： GalU DNA fragments； C： SbGT34 DNA fragments）

图2　工程菌 W303-1b/ES/SbGT34 和 W303-1b/ES/PeG/ SbGT34 生物催化合成野黄芩素-7-O-葡萄糖的相对活性比较Figure 2　Differences in the level of scutellarein 7-O-glucoside produced by strains W303-1b/ES/SbGT34 and W303-1b/ES/PeG/SbGT34 over time

图3　酿酒酵母工程菌株合成野黄芩素-7-O-葡萄糖苷的生物合成途径Figure 3　Schematic diagram of biosynthetic pathway of scutellarein 7-O-glucoside in engineering Saccharomyces cerevisiae

2.2异源高表达 PGM 和 GalU 基因提高工程菌W303-1b/ES/PeG/SbGT34 的葡萄糖苷反应活性

由于酵母细胞不具有催化黄酮类化合物葡萄糖苷化反应的活性，在酵母细胞直接表达具有催化黄酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖转移酶 SbGT34，以野黄芩素（0.2 mmol）为底物检测其催化活性，其生物催化合成的野黄芩素-7-O-葡萄糖苷的转化率约 37%；酵母细胞本身具有葡萄糖苷酶水解活性，能水解糖苷化产物，导致产物的积累水平较低。于是敲除酵母细胞葡萄糖苷水解酶基因，使得野黄芩素的转化率提高到 76%，该研究结果已经另文发表。

酵母细胞自身合成的 UDP-葡萄糖参与能量代谢、细胞壁合成等重要的生理活动，在细胞内积累水平较低。本研究通过高表达大肠杆菌的 2 个参与 UDP-葡萄糖合成的关键酶 PGM 和 GalU 用来提高工程细胞的 UDP-葡萄糖的合成水平，结果表明这 2 个功能酶的表达使得野黄芩素的转化率提高到 84%（图2），间接地证实了 PGM 和 GalU基因的高表达能够提高细胞内的 UDP-葡萄糖水平。因此，工程细胞内高表达的 2 个异源的 UDP-葡萄糖合成酶（PGM 和 GalU）和 UDP-葡萄糖转移酶（SbGT34）形成了一个完整的生物催化葡萄糖苷化反应的代谢途径（图3）。

2.3代谢产物的结构鉴定

以最适的黄酮化合物-野黄芩素为目标分子详细地研究了工程酵母细胞生物催化的效率，然后以标准野黄芩素-7-O-葡萄糖苷为参照对其葡萄糖苷化产物进行结构鉴定。反应产物经 HPLC 分析获得保留时间为 13.4 min 的产物（图4）。再利用HPLC-ESI-MS/MS 在负离子模式进行扫描，可以获得母分子离子峰 m/z = 447［M-H］-和糖基断裂产生的碎片离子 m/z = 285［M-H-162］-（图5）。

2.4不同黄酮类化合物的葡萄糖苷化

利用工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 对其他黄酮类化合物如木犀草素、柚皮素、白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素 A、野黄芩素、黄芩素、槲皮素以及大豆黄酮等进行了生物催化活性分析，结果表明工程菌体内催化与体外酶促催化结果基本一致，对不同底物的葡萄糖苷化效率不同，其中对野黄芩素催化效率最高（图6）。

图4　生物催化产物野黄芩素-7-O-葡萄糖的 HPLC 分析（A：野黄芩素-7-O-葡萄糖苷标准；B：野黄芩素底物；C：工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 催化野黄芩素的反应产物）Figure 4　HPLC analysis of scutellarein 7-O-glucoside biosynthesized through whole-cell biocatalysis （A： Standard scutellarein-7-O-glucoside； B： Standard scutellarein； C： Products of strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 with scutellarein as a substrate）

图5　生物催化产物野黄芩素-7-O-葡萄糖的质谱分析Figure 5　Scutellarein-7-O-glucoside was detected in negative ionisation mode

图6　工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 催化不同黄酮葡萄糖苷的合成Figure 6　Biotransformation of flavones into respective glucosides using the engineering strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 as biocatalyst

3　讨论

利用生物催化法进行药物的葡萄糖苷化反应，反应条件温和，立体和区域选择性高，是一个具有巨大潜力的药物结构修饰技术。目前无论是酶法还是单一表达 UDP-葡萄糖转移酶的工程菌，生物催化合成葡萄糖苷都受限于 UDP-葡萄糖供体的添加，致使难以规模化放大。为解决 UDP-葡萄糖供应不足的难题，在大肠杆菌工程菌中进行 UDP-葡萄糖生物合成途径的调控，提高了细胞内 UDP-葡萄糖合成的水平，进而促进葡萄糖苷化产物的积累［7， 12-13］。尽管在酵母细胞已有文献报道了 UDP-葡萄糖转移酶的表达［8， 14-15］，但工程细胞催化合成葡萄糖苷效率较低，其中一个限制因素是细胞自身具有葡萄糖苷酶活性，可逆地水解葡萄糖苷化产物，最终导致工程酵母细胞合成葡萄糖苷的滴度较低［8-9］。另一个潜在的限制因素是酵母细胞合成UDP-葡萄糖的水平较低。研究组已完成了酵母细胞葡萄糖苷酶的基因敲除，使得工程细胞葡萄糖苷的转化效率有了大幅度提高。本研究目的是探索提高酵母细胞内 UDP-葡萄糖的水平对工程细胞葡萄糖苷反应活性的影响。研究结果表明在酵母细胞内表达大肠杆菌参与 UDP-葡糖合成的 2 个关键酶PGM 和 GalU，使得模式分子野黄芩素-7-O-葡萄糖苷的合成效率得到进一步提高，间接地证实在酵母细胞内大肠杆菌 PGM 和 GalU 的表达能促进宿主细胞 UDP-葡萄糖的合成，为利用工程酵母细胞生物催化合成葡萄糖苷类的药物结构修饰提供了理论和实践借鉴。

所构建的工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 不仅可以催化野黄芩素发生葡萄糖苷化反应，也对其他黄酮类化合物具有较高的催化活性。工程细胞催化的这些黄酮类化合物如白杨素、汉黄芩素、木蝴蝶素 A、野黄芩素、黄芩素和大豆黄酮仅合成单一的葡萄糖苷；而催化柚皮素体系产生了 2 个葡萄糖苷产物；黄酮分子母核含有 3-羟基或 3'，4'-二羟基的槲皮素和木犀草素则被催化产生 3 个和 4 个葡萄糖苷产物，这些葡萄糖苷化合物结果还需要进一步鉴定。

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www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（3）：229-235

Optimization of biosynthetic pathway of uridine diphosphate glucose in yeast for production of flavonoid glucosides

WANG Hui-min， YANG Yan， TIAN Lei-yu， ZHOU Wen-long， WANG Wei

【Abstract】

ObjectiveTo investigate the effect of expression of phosphoglucomutase and UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase ［two key enzymes in the pathway of synthesizing uracil diphosphate glucose （UDP-glucose）］ from Escherichia coli on glucosylation capacity of engineering yeast.

MethodsIn order to up-regulate the biosynthetic pathway of UDP-glucose of Saccharomyces cerevisiae， the two genes encoding phosphoglucomutase （PGM） and UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase （GalU） of E. coli were amplified by PCR and then inserted into the yeast integration vectors. The resulting plasmids were linearized by restriction enzyme Not I and transformed into the engineering strain. The integration expression plasmid pδGAPg-SbGT34 with a UDP-glucose flavonoid glucosyltransferase gene cloned from Scutellaria baicalensis Georgi was also constructed and further integrated into the basic engineering strain W303-1b/ES/PeG. The effect of high expression of PGM and GalU on production of flavonoid glucosides was investigated using the engineered strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 as whole-cell biocatalyst under the flask culture condition.

ResultsThe engineering strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 with the high expression of PGM and GalU genes involving the biosynthesis of UDP-glucose together with the glucosyltransferase was successfully constructed. Its production of scutellarein 7-O-glucoside was further improved in comparison with that of strain W303-1b/ES/SbGT34. It is indicated that the expression of heterologous PGM and GalU genes of E. coli contributes to the synthesis of endogenous UDP-glucose of engineering strain. The resulting strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 also glucosylated the flavonoids such as luteolin， naringenin， chrysin， wogonin， orohylin A， baicalein， quercetin and daidzein.

ConclusionThe synthesis of endogenous UDP-glucose of yeast was boosted through the co-expression of PGM and GalU genes isolated from E. coli， which improves the glycosylation capacity of the engineered strain along with expression of a UDP-glucose falvonoid glucosyltransferase.

【Key words】Flavores；Uridine diphosphate glucose；Saccharomyces cerevisiae；Phosphoglucomutase；Glucosyltransferase Author Affiliation: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health and Family Planning Commission， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， 100050 Beijing， China

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.006

基金项目：国家自然科学基金（81072562）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301002）

通信作者：王伟，Email：wwang@imm.ac.cn

收稿日期：2016-04-05

Corresponding Author:WANG Wei， Email： wwang@imm.ac.cn