系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Toll样受体9和核因子-κB水平的测定及其临床意义

陈海莲，杨晓娥

（1.山东省菏泽市立医院皮肤科，山东菏泽274000；2.山东省曹县县立医院皮肤科，山东曹县274400）



系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Toll样受体9和核因子-κB水平的测定及其临床意义

陈海莲1，杨晓娥2

（1.山东省菏泽市立医院皮肤科，山东菏泽274000；2.山东省曹县县立医院皮肤科，山东曹县274400）

摘要：目的测定系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMCs）Toll样受体9（TLR9）和核因子-κB（NF-κB）水平并分析其临床意义。方法选取2013年4月-2014年12月该院风湿免疫科收治的60例SLE患者作为研究对象，其中35例SLE患者处于活动期作为活动组，25例SLE患者处于缓解期作为缓解组。同时选取该院健康体检者30例作为对照组。对比3组PBMCs中TLR9和NF-κB水平，观察SLE患者PBMCs 中TLR9、NF-κB水平与脏器受累和免疫抑制剂种类的相关性。结果活动组PBMCs中TLR9水平低于缓解组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；缓解组PBMCs中TLR9水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。活动组PBMCs中NF-κB水平低于缓解组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；缓解组PBMCs中NF-κB水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。皮疹、白细胞降低表现阳性患者与阴性患者PBMCs 中TLR9水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。发热、浆膜炎、血尿表现阳性患者与阴性患者PBMCs中TLR9水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。浆膜炎、血尿表现阳性患者与阴性患者PBMCs中NF-κB水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。发热、皮疹、白细胞降低表现阳性患者与阴性患者PBMCs中NF-κB水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论SLE患者TLR9水平较正常人群明显降低，NF-κB水平较正常人群明显升高，同时TLR9水平的降低与发热、浆膜炎、血尿的临床表现相关。NF-κB水平升高与发热、皮疹、白细胞降低的临床表现相关，严密监测SLE患者PBMCs中TLR9和NF-κB水平变化对患者的临床诊治有重要价值。

关键词：系统性红斑狼疮；外周血单个核细胞；Toll样受体9；核因子-κB；水平测定；临床意义

1　资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年4月-2014年12月本院风湿免疫科收治的60例系统系红斑狼疮患者作为研究对象。其中，35例SLE患者处于活动期作为活动组，25 例SLE患者处于缓解期作为缓解组。同时，选取本院健康体检者30例作为对照组。全部患者在本院确诊，并签署知情同意书，本实验经本院医学伦理学会审核。活动组男性4例，女性31例；年龄15～61岁，平均（35.2±9.8）岁；病程2～12年，平均（5.3±2.4）年。缓解组男性3例，女性22例；年龄14～60岁，平均（35.4±8.9）岁；病程3～11年，平均（5.6±2.5）年。对照组男性4例，女性26例；年龄12～61岁，平均（36.3±9.4）岁；病程2～11年，平均（5.1±3.1）年。两组性别、年龄、病程等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准

①年龄10～65岁；②符合现代内科学第4版关于系统性红斑狼疮的诊断标准；③患者依从度高，可以完成实验计划；④临床资料齐全；⑤告知本研究目的、方法及意义，同意参加并签署同意书。

1.3 排除标准

①合并强制性脊柱炎、类风湿性关节炎、骨关节炎等免疫系统疾病；②合并肿瘤、糖尿病、妊娠等。

1.4 实验方法

有诗云：重重叠叠众峰开，一脉空谷通宇外；坐堂可览玉皇顶，莫非天公巧安排 ？人人都知泰山玉皇顶，历代帝王欣然前往这里筑坛祭天，后来逐渐变成了人们登高望远、凭眺祖国大好河山的地方。而除了近距离的登临，如今只需坐在三泰宾馆的大堂内，就能远眺玉皇顶。

1.4.1 分离外周血单个核细胞上午7∶00所有系统性红斑狼疮患者及健康体检者在无菌操作下采集空腹静脉血5 ml，放置于抗凝试剂管内，与磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）等比例充分混合后摇匀。将5 ml细胞分离液缓慢加入混合液中，在15 cm半径水平转子的离心机上以2 000 r/m离心20 min。离心后离心管内液体分为4层，第1层以血清为主，第2层以乳白色单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）为主，第3层是透明分离层，第4层以红细胞为主。采集第2层液体后加入细胞洗涤液12ml，摇匀后以1500r/min离心10min，舍弃上清液后取沉淀PBMCs得PBMCs悬液。

1.4.2 外周血PBMCs中TLR9水平测定将取得的PBMCs悬液加入到2.5 ml RNase Free的Eppendorf（EP）试剂管内，2 000 r/min离心5 min，加入1.5 ml Trizol液体，室温静置3 min，舍弃上清液后加入500 ul异丙醇充分摇匀，加入3.5 ml RNase Free EP管内，将EP管置于冰水混合物上，加入30ul焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水解RNA沉淀物，30 min后再将EP试剂管加入60℃水浴器中水浴10 min，促使RNA沉淀物充分溶解。依照TLR9基因序列，由上海生共生物工程集团公司合成提供模板RNA。将模板RNA加入RNase Free试剂管，放置于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪，65℃孵育5 min后冷却3 min，振荡摇匀，放置于PCR仪进行逆转录反应，反应条件如下：45℃预变性60 min，70℃变性5 min，4℃退火5 h，置入-20℃冰箱冷冻保存cDNA。使用免疫荧光定量测定法依据cDNA测定TLR9水平，cDNA模板在正、反向引物引导下进行反应，最终样品用美国辉瑞Green Texas分析仪测出TLR9水平。

1.4.3 外周血PBMCs中NF-κB水平测定由上海生共生物工程集团公司提供NF-κB结合的DNA引物，采用寡核苷酸激酶法以r-P-ATP（15 mCi/ml）标记NF-κB探针。在PBMCs溶液中加入3 ml Ficoll溶液，1 800 r/min离心5 min，弃上清液后加入生理盐水冲洗，加入匀浆缓冲液和核提取液萃取NF-κB结合蛋白，以等量的核蛋白提取液加入r-PATP（标记NF-κB的探针液），摇匀使两者充分结合，45 g/L聚丙烯凝胶电泳后立即用X放射线显影，分析NF-κB水平。

1.5 观察指标

比较3组外周血单个核细胞TLR9和NF-κB水平。分析系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞TLR9、NF-κB水平与脏器受累和免疫抑制剂种类的相关性。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，计数资料以率表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 一般资料比较

活动组女性比例、年龄、病程与缓解组比较，差异无统计学意义（χ2=0.004、1.542和0.973，P=0.900、0.777和0.936）。活动组女性比例、年龄、病程与对照组比较，差异无统计学意义（χ2=0.021、1.790和1.236，P=0.683、0.777和0.647）。缓解组女性比例、年龄、病程与对照组比较，差异无统计学意义（χ2=0.241、0.891和1.265，P=0.719、0.771和0.519）。见表1。

表1　3组患者一般资料比较

2.2 3组外周血单个核细胞TLR9水平比较

活动组外周血单个核细胞TLR9水平为（0.52± 0.26），低于缓解组（1.25±0.43）和对照组（2.21± 0.57），差异有统计学意义（t=10.624，P=0.000；t=12.841，P=0.000）。缓解组外周血单个核细胞TLR9水平低于对照组，差异有统计学意义（t=5.397，P=0.025）。

2.3 3组外周血单个核细胞NF-κB水平比较

活动组外周血单个核细胞NF-κB水平低于缓解组和对照组，差异有统计学意义（t=15.703，P=0.000；t=22.322，P=0.000）。缓解组外周血单个核细胞NF-κB水平低于对照组，差异有统计学意义（t=4.770，P=0.034）。

2.4 SLE患者外周血单个核细胞TLR9水平与脏器受累的相关性

皮疹、白细胞降低表现阳性患者与阴性患者外周血单个核细胞TLR9水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。发热、浆膜炎、血尿表现阳性患者与阴性患者外周血单个核细胞TLR9水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　SLE患者脏器受累与外周血单个核细胞TLR9水平的相关性

2.5 SLE患者外周血单个核细胞NF-κB水平与脏器受累的相关性

浆膜炎、血尿表现阳性患者与阴性患者外周血单个核细胞NF-κB水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。发热、皮疹、白细胞降低表现阳性患者与阴性患者外周血单个核细胞NF-κB水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3　SLE患者脏器受累与外周血单个核细胞NF-κB水平的相关性

3　讨论

3.1 SLE与当今TLR9和NF-κB研究成果

SLE是一种免疫相关疾病，发病过程中细胞免疫、体液免疫紊乱及自身抗体的产生是重要的致病因素［5］。系统性红斑狼疮临床表现差异很大，多种器官脏器均可受累，一旦病情发展恶化，最终可出现多器官衰竭而死亡，因此对系统性红斑狼疮发病机制及诊断的研究显得十分重要。目前，对于系统性红斑狼疮的诊断主要以抗核抗体ANA、抗dsDNA抗体等血生化指标为主［6］，但是多年的临床应用结果表明，该检测效果不能令人满意。Toll样受体9是一种固有免疫受体，不仅直接参与抵抗病原微生物的侵袭，同时通过释放特异的炎症因子和启动相应免疫细胞在免疫应答中发挥重要作用。美国学者CHONG等［7］研究发现，在狼疮鼠构建的模型中，TLR9可通过MyD81信号传导通路活化B细胞的增殖活动，产生dsDNA抗体，刺激抗原提呈细胞表面共刺激受体的过度表达，而当选择性抑制PBMCs内TLR9表达后，狼疮鼠体内自身抗体减少，系统性红斑狼疮的症状减轻。NF-κB是一种重要的转录调控因子［8-10］，主要通过与启动子及增强子的作用，促进多种细胞因子及免疫细胞的活化，在免疫应答早期发挥至关重要的作用。NF-κB是一种以二聚体形式存在的核因子，由p50和p65两个亚基组成。NF-κB活化后可进入细胞核内［11-12］，调控TNF-β和IL-1的表达。因为TLR9和NF-κB在系统性红斑狼疮发病中起重要作用，已成为系统性红斑狼疮研究中的热点。目前，风湿免疫学界对TLR9和NF-κB的研究仍处于较早期的阶段，对TLR9和NF-κB在系统性红斑狼疮发病中的确切作用仍不是很了解［13］。

3.2 SLE患者外周血PBMCs中TLR9和NF-κB水平及其与脏器受累的相关性

本实验结果发现，SLE活动期患者PBMCs中TLR9水平明显低于缓解期患者和健康人群，而SLE缓解期患者TLR9水平又明显低于体检健康人群，提示外周血PBMCs中TLR9水平在SLE活动期患者最低，正常人群最高，SLE缓解期患者介于两者之间。而在SLE活动期患者PBMCs中NF-κB水平明显高于缓解期患者和健康人群，而SLE缓解期患者NF-κB水平又明显高于体检健康人群，提示外周血PBMCs中TLR9水平在SLE活动期患者最高，正常人群最低，SLE缓解期患者介于两者之间［14-15］。在对外周血PBMCs中TLR9、NF-κB与SLE受累脏器的相关性研究中发现，皮疹、白细胞降低表现阳性患者与阴性患者外周血单个核细胞TLR9水平比较，差异无统计学意义；发热、浆膜炎、血尿表现阳性患者PBMCs中TLR9水平较阴性患者明显降低。浆膜炎、血尿表现阳性患者与阴性患者外周血单个核细胞NF-κB水平比较，差异无统计学意义；发热、皮疹、白细胞降低表现阳性患者PBMCs中NF-κB水平较阴性患者明显升高。

综上所述，系统性红斑狼疮患者TLR9水平较正常人群显著降低，NF-κB水平较正常人群显著升高。同时TLR9水平的降低与发热、浆膜炎、血尿的临床表现相关，NF-κB水平升高与发热、皮疹、白细胞降低的临床表现相关。严密监测系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞TLR9和NF-κB水平变化对患者的临床诊疗有重要价值。

参考文献：

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（童颖丹编辑）

新进展研究

TLR9 and NF-κB levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with systemic lupus erythematosus and their clinical significance

Ha-lian Chen1，Xiao-e Yang2
（1. Department of Dermatology，Heze Manicipal Hospital，Heze，Shangdong 274000，China；2. Department of Dermatology，Caoxian County Hospital，Caoxian，Shandong 274400，China）

Abstract:Objective To explore and analyze the levels of toll-like receptor 9（TLR9）and nuclear factorκB（NF-κB）in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of patients with systemic lupus erythematosus （SLE）and its clinical significance. Methods Sixty SLE patients in the Department of Rheumatology and Immunology of our hospital from April 2013 to December 2014 were selected as the research objects，including 35 SLE patients in active stage as active group and 25 cases of SLE patients in remission stage as remission group. At the same time，30 healthy cases in our hospital were selected as control group. TLR9 and NF-κB levels in PBMCs were compared between the three groups. The correlations of TLR9 and NF-κB levels inPBMCs with organ involvement and types of immunosuppressants were observed. Results The level of TLR9 in PBMCs of the active group was significantly lower than that of the remission group and the control group （P＜0.05）. The level of TLR9 in PBMCs of the remission group was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）. The level of NF-κB in PBMCs in the active group was significantly lower than that of the remission group and the control group（P＜0.05）. The level of NF-κB in PBMCs of the remission group was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）. The TLR9 in PBMCs in the patients with skin rash and decreased white blood cells was not significantly different from that in the patients without skin rash or decreased white blood cells（P＞0.05）. The TLR9 level in PBMCs of the patients with fever，serositis or hematuria was significantly different from that of the patients without fever，serositis or hematuria（P＜0.05）. There was no significant difference in the NF-κB level between the patients with and the patients without serositis or hematuria（P＞0.05）. The level of NF-κB in PBMCs of the patients with serositis or hematuria was not significantly different from that of the patients without serositis or hematuria. The level of NF-κB in PBMCs of the patients with fever，rash or decreased white blood cells was statistically different from that in PBMCs of the patients with negative findings（P＜0.05）. Conclusions TLR9 level significantly decreases while NF-κB level significantly increases in patients with systemic lupus erythematosus compared to that in normal population. Decreased TLR9 level is correlated with fever，serositis and hematuria. Increased NF-κB level is correlated with fever，rash and reduced white cell count. Close monitoring of TLR9 and NF-κB level changes in PBMCs of system lupus erythematosus patients has important value in clinical diagnosis and treatment of the disease.

Keywords:systemic lupus erythematosus；peripheral blood mononuclear cell；toll-like receptor 9；nuclear factor-κB；clinical significance

中图分类号：R593.241

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.013

文章编号：1005-8982（2016）11-0063-05

收稿日期：2015-05-25